รากฐานคราบไรท์วัสดุเทคนิคและการใช้งาน

รอยเปื้อนของ Wrigth เป็นเทคนิคการระบายสีที่สร้างขึ้นโดยนักพยาธิวิทยาชาวอเมริกันเจมส์โฮเมอร์ไรท์ในปี 1902 จากคราบของ Romanowsky ในฐานะที่เป็นคราบ Romanowsky ไม่มั่นคง Wrigth รวมเมทานอลเป็นตัวทำละลายและตรึง.

สีนี้เป็นสีน้ำวนซึ่งหมายความว่ามันสร้างหลายสีขึ้นอยู่กับโครงสร้างที่ย้อมสีดูดซับ เทคนิคการย้อมสีนี้ใช้กันอย่างแพร่หลายในการตรวจนับเม็ดเลือดขาวและศึกษาสัณฐานวิทยาของเซลล์เม็ดเลือดแดงเกล็ดเลือดและเม็ดเลือดขาวในเลือดและไขกระดูก.

การใช้งานมีความสำคัญมากเนื่องจากความผิดปกติสามารถมองเห็นได้ในสายเซลล์ที่แตกต่างกันของเลือดช่วยอำนวยความสะดวกในการวินิจฉัยโรคเช่นโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวหรือการติดเชื้อแบคทีเรียหรือพยาธิ.

บางทีนี่อาจเป็นแอพพลิเคชั่นทั่วไปที่ใช้เทคนิคนี้ แต่ไม่ใช่แอพพลิเคชั่นเดียวเท่านั้น นอกจากนี้ยังมีประโยชน์ในตัวอย่างอื่นนอกเหนือจากเลือดและไขกระดูกเช่นตัวอย่างน้ำมูก, มูกอุจจาระ, เสมหะ, ผิวหนัง, และอื่น ๆ.

ดัชนี

• 1 รากฐานของคราบไรท์
• 2 วัสดุ
  • 2.1 การเตรียมการ
  • 2.2 สารละลายบัฟเฟอร์บัฟเฟอร์
  • 2.3 วัสดุเพิ่มเติมที่จำเป็นในการทำสี
• 3 องค์ประกอบของคราบไรท์
  • 3.1 เมทานอล
  • 3.2 The โช้คอัพ
  • 3.3 Eosin (Y)
  • 3.4 Methylene สีน้ำเงิน
• 4 เทคนิค
• 5 ยูทิลิตี้
  • 5.1 โลหิตวิทยา
  • 5.2 การหลั่งจมูก
  • 5.3 ปรสิตวิทยา
  • 5.4 การติดเชื้อทางเดินหายใจ
  • 5.5 แบคทีเรียวิทยา
  • 5.6 Mycology
• 6 สังเกตโครงสร้างของตัวอย่างเลือดด้วยรอยเปื้อนของไรท์อย่างไร?
• 7 คำแนะนำสำหรับการย้อมสีที่ดี
• 8 ข้อผิดพลาดทั่วไปในการระบายสี Wrigth
  • 8.1 การย้อมสีซีดมาก
  • 8.2 การตกตะกอนของสี
  • 8.3 สเมียร์ที่มีสีแดงหรือน้ำเงินมาก
• 9 โหมดการจัดเก็บ
• 10 อ้างอิง

รากฐานการย้อมสีของไรท์

ไรท์เป็นคราบเกิดจากคราบของ Romanowsky ซึ่งประกอบด้วยสารละลายของเมทิลแอลกอฮอล์จากสีย้อมกรด (eosin Y) และสีย้อมพื้นฐาน (เมทิลีนสีน้ำเงิน) และผลิตภัณฑ์ออกซิเดชั่น.

ส่วนผสมของสีย้อมที่ใช้ในคราบของไรท์ทำให้เกิดผลที่รู้จักกันในชื่อ Romanowsky นั่นคือมันให้สีม่วงที่สวยงามแก่นิวเคลียสของเม็ดเลือดขาวและเม็ดนิวโทรฟิลในขณะที่เซลล์เม็ดเลือดแดงจะเป็นสีชมพู.

องค์ประกอบที่รับผิดชอบในการกำหนดช่วงสีโดยทั่วไปของคราบไรท์คือสีน้ำเงิน B และอีโอซิน Y ผลที่สังเกตได้จะขึ้นอยู่กับการยึดเกาะของสีย้อมกับโครงสร้างทางเคมีและปฏิกิริยาของสีน้ำเงิน B และอีโอซิน Y.

โครงสร้างที่เป็นกรดเช่นกรดนิวคลีอิกโปรตีนนิวเคลียร์และไซโตพลาสซึมปฏิกิริยาที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะของเซลล์บางชนิดตรึงสีฟ้า B (สีย้อมพื้นฐาน).

ในขณะที่โครงสร้างพื้นฐานเช่นเฮโมโกลบิน, แกรนูลของ eosinophils แบ่งส่วน, ในโครงสร้างของเซลล์อื่น ๆ , แก้ไข eosin Y (สีย้อมสีกรด).

ผลของการย้อมสีสามารถได้รับอิทธิพลจากปัจจัยต่าง ๆ เช่นค่าความเป็นกรดด่างของไรท์สีย้อมบัฟเฟอร์และน้ำยาล้าง เช่นเดียวกับการย้อมสีและแก้ไขเวลา.

ดังนั้นแต่ละขั้นตอนในการจัดเตรียมรีเอเจนต์จึงเป็นสิ่งสำคัญและจะต้องดูแลทุกรายละเอียด.

วัสดุ

ไรท์ระบายสี สำหรับ 100 มล. จำเป็นต้องมี:

น้ำหนักย้อมสีไรท์ 0.3 กรัมวัดเมทานอล 97 มล. และกลีเซอรอล 3 มล.

การจัดเตรียม

ในครกให้ใส่สีย้อมจำนวนมากของไรท์แล้วค่อยๆเติมกลีเซอรอลลงไปเรื่อย ๆ จนกว่าผงจะละลายหมด.

จากนั้นเติมเมทานอลผสมและเทลงในขวดสีเหลืองอำพัน.

ก่อนที่จะใช้วิธีการแก้ปัญหาควรเขย่าด้วยการเคลื่อนไหวที่อ่อนโยนและตัวกรอง.

บัฟเฟอร์บัฟเฟอร์

ในน้ำกลั่นหนึ่งลิตรจะมีไดโซเดียมไฮโดรฟอสเฟต 3.76 กรัม₂HPO₄   2H₂0) บวก 2.1 กรัมของโพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (KH)₂PO₄).

ผสมให้เข้ากันดีจนน้ำยาละลายรวมอยู่ ปรับค่า pH เป็น 7.2 เทลงในขวดแก้วและเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง.

วัสดุเพิ่มเติมที่จำเป็นในการทำสี

นอกจากนี้วัสดุอื่น ๆ จะต้องดำเนินการเทคนิคการระบายสีเหล่านี้คือ: แผ่นถือวัตถุหรือครอบคลุมวัตถุสะพานของสี, pisetas ด้วยน้ำหรือบัฟเฟอร์สำหรับซักผ้า, นาฬิกาจับเวลาที่จะใช้เวลาในการระบายสีและวัสดุการอบแห้งบางอย่าง (กระดาษดูดซับ, ผ้ากอซหรือผ้าฝ้าย).

องค์ประกอบรอยเปื้อนไรท์

เมทิลแอลกอฮอล์

แอลกอฮอล์ (เมทานอล) ทำหน้าที่เป็นตัวตรึงของรอยเปื้อนเลือดในสไลด์.

โดยทั่วไปจะเป็นน้ำยาลด dehydrator และตกตะกอนตกตะกอน ดังนั้นหน้าที่ของมันคือการจับตัวเป็นก้อนโปรตีนและทำให้มันไม่ละลายน้ำ แต่ไม่สามารถทำลายได้.

เมทานอลเป็นรีเอเจนต์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายเพื่อแก้ไขรอยเปื้อนในห้องปฏิบัติการทุกแห่ง ความเข้มข้นในอุดมคติคือ 99%.

โช้คอัพ

บัฟเฟอร์ (สารละลายบัฟเฟอร์) มีฟังก์ชั่นของการปรับหรือรักษาค่า pH ของสีย้อมเนื่องจากค่า pH ที่ปรับได้ถึง 7.2 เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับโครงสร้างเซลล์ในการดูดซับสีย้อมอย่างเหมาะสม.

ในทางตรงกันข้ามการตรึงเมทิลแอลกอฮอล์จะทำให้เซลล์ขาดน้ำและบัฟเฟอร์จะช่วยให้พวกมันกลับมามีชีวิตชีวา.

Eosin (Y)

Eosin มีความเกี่ยวข้องกับส่วนประกอบพื้นฐานเพราะเป็นสีย้อมกรด อีโอซินสองประเภทมีความคล้ายคลึงกันมากดังนั้นจึงสามารถใช้หนึ่งในสองแบบนี้เพื่อให้ได้ผลลัพธ์เดียวกัน.

หนึ่งเรียกว่า eosin Y, eosin สีเหลืองหรือ tetrabromofluorescein และ eosin B อื่น ๆ , สีน้ำเงิน erythrosin B หรือ dibromodinitrofluorescein อย่างไรก็ตาม eosin Y เป็นที่ใช้กันมากที่สุด.

คุณสมบัติที่สำคัญที่สุดของสีย้อมนี้คือขั้วลบทำให้สิ่งนี้ดึงดูดโดยโครงสร้างของเซลล์ที่มีประจุเป็นบวก.

เมทิลีนสีน้ำเงิน

มันเป็นสีพื้นฐาน คุณสมบัติหลักของมันคือ metachromasia นั่นคือไม่ใช่โครงสร้างทั้งหมดจะถูกย้อมสีเดียวกันมันขึ้นอยู่กับองค์ประกอบทางเคมีของโครงสร้างที่เป็นสี.

บางชนิดจะเปลี่ยนเป็นสีอ่อนหรือสีน้ำเงินเข้มและสีม่วงเข้มหรือสีม่วงอ่อน.

เทคนิค

1- ดำเนินการแพร่กระจายของตัวอย่างเพื่อให้ฟิล์มบางยังคงอยู่ทั้งบนภาพนิ่งหรือฝาปิด.

2- ปล่อยให้อากาศแห้งประมาณ 2 ชั่วโมง.

3- วางป้ายสเมียร์แห้งบนสะพานย้อมสีหรือถาดย้อมด้วยตัวอย่างกระจาย.

4- คลุมแผ่นด้วยการย้อมสีไรท์ทีละหยดจนกว่าจะครอบคลุมพื้นผิวทั้งหมด ทิ้งไว้ประมาณ 5 - 8 นาที.

5-The dye ควรครอบคลุมภาพนิ่งอย่างสมบูรณ์โดยไม่ทะลักขอบ หากในช่วงเวลาการระบายสีมันเริ่มที่จะระเหยควรวางหยดเพิ่มเติม.

6-Sub จากนั้นเพิ่มโช้คอัพในปริมาณที่เท่ากันเป่าเล็กน้อยจนกว่าจะมีลักษณะเป็นเงาโลหะ ใช้เวลา 10 ถึง 15 นาที.

7-Wash ด้วยน้ำประปาวาง jet soft จนกว่าแผ่นจะดูเป็นสีชมพู.

8- ด้วยผ้ากอซชุบแอลกอฮอล์เอาสีย้อมที่ติดอยู่ด้านหลังของสไลด์.

9-smear ให้แห้งได้ดีมากก่อนที่จะวางน้ำมันแช่เพื่อให้เห็นภาพในกล้องจุลทรรศน์.

ประโยชน์

โลหิตวิทยา

เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการทารอยเปื้อนเลือดรอบข้างเพื่อตรวจรอยเปื้อนเลือดหนาและสำหรับการศึกษาเซลล์จากตัวอย่างไขกระดูก.

เนื่องจากคุณสมบัติทางเคมีของสีผสมนี้ทำให้สามารถรับรู้โครงสร้างของเซลล์ได้อย่างง่ายดายสามารถแยกแยะเซลล์ชนิดต่าง ๆ ที่มีอยู่ได้.

การหลั่งจมูก

เทคนิคนี้มีประโยชน์มากในการระบุเซลล์ของการหลั่งจมูก (เซลล์เยื่อบุผิวแบ่ง eosinophils, polymorphonuclear) ในการวินิจฉัยโรคจมูกอักเสบจากภูมิแพ้.

ปรสิตวิทยา

ในแง่นี้มันมีประโยชน์สำหรับการศึกษา Leishmania sp ภายใน histiocytes ของเนื้อเยื่อเซลล์ใต้ผิวหนังในแผลที่ผิวหนัง เช่นเดียวกันมันถูกใช้เพื่อระบุเม็ดเลือดขาวในอุจจาระตัวอย่าง (อุจจาระ leucogram).

ในกรณีนี้มันเป็นเรื่องที่น่าสนใจสำหรับแพทย์ที่จะทราบว่า leukocytosis ที่มีอยู่ในอุจจาระนั้นเกิดจาก polymorphonuclear หรือ mononuclear การค้นพบนี้ใน fucal leucogram จะเป็นแนวทางในการติดเชื้อแบคทีเรียหรือไวรัสตามลำดับ.

ในทางกลับกันปรสิตที่ไหลเวียนอยู่ในเลือดสามารถพบได้ในเม็ดเลือดแดงหรือเป็นอิสระในพลาสมา ปรสิตที่ต้องการคือ พลาสโมเดียม spp, Trypanosoma cruzii และฟิลาเรียและในสัตวแพทยศาสตร์มันมีประโยชน์ในการค้นหา Theileria equi และ Babes Caballi, ตัวแทนสาเหตุของทารกโดยเฉพาะอย่างยิ่งใน equines.

Wright และ Giemsa stain สามารถแยกความแตกต่างของฮีโมพาราไซต์ออกจากส่วนประกอบของเซลล์ปกติ สำหรับสิ่งนี้คุณสามารถใช้สเปรดสองประเภท:

เหยียดดี

เลือดจะกระจายออกไปเหมือนแผ่นฟิล์มบาง ๆ บนแผ่นสไลด์ ย้อมด้วยรอยเปื้อนของไรท์เผยให้เห็นลักษณะของนิวเคลียสและไซโตพลาสซึม.

หล่นหนา

วิธีการนี้ใช้เพื่อตรวจสอบการปรากฏตัวของปรสิตในเลือดจำนวนมาก.

สำหรับเรื่องนี้มีหยดเลือดขนาดใหญ่วางอยู่บนภาพนิ่ง เมื่อถึงจุดนั้นคุณควรทำการปรับเทียบทำให้วงกลมใหญ่ขึ้นและใหญ่ขึ้นจากจุดศูนย์กลางออกไปด้านนอกโดยใช้ขอบของสไลด์อื่น.

ในที่สุดเพื่อสังเกตปรสิตในรอยเปื้อนหนาเม็ดเลือดแดงจะต้อง lysed ด้วยน้ำ.

การติดเชื้อทางเดินหายใจ

ในระดับระบบทางเดินหายใจเทคนิคนี้ยังมีประโยชน์เพราะเซลล์ที่มีอยู่ในตัวอย่างเสมหะ, หลอดลมหรือล้างหลอดลมมีความสำคัญในการสร้างการวินิจฉัย.

ในทำนองเดียวกันเซลล์ polymorphonuclear และเซลล์ mononuclear สามารถแยกความแตกต่างได้ที่นี่.

วิชาบัคเตรี

การใช้เทคนิคนี้ในแบคทีเรียวิทยามีข้อ จำกัด เนื่องจากไม่ดีสำหรับการย้อมสีแบคทีเรียนั่นคือเหตุผลที่ใช้เทคนิคการย้อมสีแบบพิเศษอื่น ๆ.

อย่างไรก็ตามมันถูกใช้เพื่อค้นหาเซลล์เยื่อบุผิวที่มีร่างกายรวมของ Chlamydia trachomatis ในรอยเปื้อนของท่อปัสสาวะหรือเยื่อบุโพรงมดลูก endocervical แม้ว่ามันจะต้องได้รับการยอมรับว่ามันไม่ใช่วิธีที่ดีที่สุดสำหรับเรื่องนี้.

นอกจากนี้ยังเป็นไปได้ที่จะสังเกตเห็นแบคทีเรียชนิดเกลียวในเซลล์เม็ดเลือดแดงเช่น Borrelia burgdorferi ในผู้ป่วยที่ติดเชื้อเช่นเดียวกับ morulae หรือร่างกายรวมของ Ehrlichia sp ในพลาสซึมของเซลล์เม็ดเลือดขาว, monocytes หรือนิวโทรฟิลในสเมียร์เลือด.

วิชาว่าด้วยเห็ดรา

ฮีสโตพลาสม่าแคปซูล เป็นเชื้อราที่ทำให้เกิดโรคการวินิจฉัยบ่อยครั้งโดยการสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ของตัวอย่างเนื้อเยื่อต่าง ๆ เปื้อนด้วยคราบของไรท์.

โครงสร้างของตัวอย่างเลือดสังเกตได้อย่างไรด้วยรอยด่างของไรท์?

คำแนะนำสำหรับการย้อมสีที่ดี

การขยายตัวอย่างเลือดควรเป่าให้แห้งตามธรรมชาติ รอยเปื้อนควรบางที่สุดเท่าที่จะทำได้เพื่อให้ได้สีย้อมที่ดีขึ้นและหลีกเลี่ยงการทำให้สีซีดมากเกินไป.

สำหรับการย้อมคุณภาพสูงขอแนะนำให้ทำการย้อมสีในช่วงสองชั่วโมงหลังจากการเตรียมสเมียร์ ในทางตรงกันข้ามตัวอย่างที่ดีที่สุดคือเลือดฝอยโดยไม่มีสารกันเลือดแข็ง.

อย่างไรก็ตามหากใช้เลือดดำก็ควรใช้เป็นสารกันเลือดแข็ง EDTA และไม่ heparin เนื่องจากหลังสามารถเปลี่ยนโครงสร้างเซลล์.

เพื่อป้องกันการเสื่อมสภาพของสีที่เตรียมไว้ควรเก็บไว้ในที่แห้ง.

ในระหว่างกระบวนการซักแนะนำให้ใช้น้ำที่ปรับค่า pH เป็นกลาง.

ในที่สุดก็แนะนำให้ทดสอบวิธีการย้อมที่ใช้ในห้องปฏิบัติการทุก ๆ ครั้ง.

ทำได้โดยการย้อมตัวอย่างหรือขยายลวดลายเพื่อเป็นการควบคุมคุณภาพ ขั้นตอนนี้มีความสำคัญเนื่องจากช่วยให้มั่นใจว่าการย้อมสีจะได้รับการจัดเตรียมอย่างถูกต้องและเวลาในการระบายสีได้มาตรฐาน.

หากแผ่นลวดลายมีสีไม่ดีแสดงว่ามีปัญหาที่ต้องแก้ไข.

ข้อผิดพลาดทั่วไปในการระบายสี Wrigth

การย้อมสีซีดมาก

รอยเปื้อนสีซีดมากมักเกิดจากการย้อมสีในระยะเวลาอันสั้นหรือน้ำยาซักผ้าที่พูดเกินจริงมาก มันถูกแก้ไขโดยการยืดเวลาสัมผัสด้วยสีย้อมหรือโดยลดเวลาการซัก.

สีตกตะกอน

การปรากฏตัวของสีย้อมตกตะกอนในสเมียร์สามารถมีหลายสาเหตุอย่างไรก็ตามสาเหตุที่พบบ่อยที่สุดคือ: การใช้สีย้อมที่ไม่มีการกรองย้อมสีบนสะพานสีไม่สม่ำเสมอใช้แผ่นสกปรกด้วยฝุ่นหรือไขมันไม่ดีล้างที่ เสร็จสิ้นการย้อมสี.

เปื้อนด้วยสีแดงหรือสีน้ำเงินมาก

บัฟเฟอร์รับผิดชอบค่าความเป็นกรดด่างของสี สีย้อมที่มีค่าความเป็นกรดต่ำกว่าค่าที่ระบุ (กรด) จะส่งผลให้เกิดรอยเปื้อนสีแดงมาก.

หากค่า pH ของสีย้อมอยู่เหนือ (อัลคาไลน์) จะได้รับ smear สีน้ำเงินมาก.

โหมดการจัดเก็บข้อมูล

รีเอเจนต์ควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง.

การอ้างอิง

1. Gutiérrez V. การศึกษาเปรียบเทียบระหว่างวิธีการย้อมสีไรท์และการทดสอบ Elisa สำหรับการวินิจฉัยโรค Ehrlichiosis canina ในเมืองซานเปโดรซูลาฮอนดูรัส 2551. ปริญญานิพนธ์ที่จะใช้สำหรับตำแหน่งของแพทย์สัตวแพทย์ มหาวิทยาลัยซานคาร์ลอสเดอกัวเตมาลา.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. การย้อมสีพื้นฐานในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา. งานวิจัยด้านคนพิการ 2014; 3 (1): 10-18.
3. "รอยเปื้อนของไรท์" Wikipedia, สารานุกรมฟรี. 18 พฤษภาคม 2018, 12:05 UTC 8 ธันวาคม 2018, 20:37
4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó ความถี่ของ Babesia spp. ใน horses of montería, คอร์โดบา (โคลัมเบีย). รายได้ udcaactual divulg cient.  2013; 16 (2): 451-458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009) การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยาของ Bailey & Scott 12 เอ็ด อาร์เจนตินา Panamericana S.A บทบรรณาธิการ.
6. Retamales E, Mazo V. สถาบันสาธารณสุขรัฐบาลชิลี คำแนะนำสำหรับการย้อมสีเปื้อนเลือดสำหรับการอ่านจำนวนเลือด.