รากฐานการย้อมสี Giemsa, วัสดุ, เทคนิคและการใช้งาน



คราบ Giemsa เป็นประเภทของการย้อมสีของตัวอย่างทางคลินิกตามส่วนผสมของกรดและสีย้อมพื้นฐาน การสร้างสรรค์ของมันได้รับแรงบันดาลใจจากงานที่ทำโดย Romanowsky ซึ่ง Gustav Giemsa นักเคมีและแบคทีเรียมีพื้นเพมาจากประเทศเยอรมนีที่สมบูรณ์แบบโดยการเพิ่มกลีเซอรอลเพื่อรักษาเสถียรภาพของสารประกอบ.

การเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นกับเทคนิคดั้งเดิมของ Romanowsky ได้รับอนุญาตให้ปรับปรุงการสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ได้อย่างมากดังนั้นเทคนิคนี้จึงได้รับการล้างบาปด้วยชื่อของ Giemsa stain.

เนื่องจากเป็นเทคนิคที่ง่ายต่อการปฏิบัติงานมีประสิทธิภาพสูงและประหยัดปัจจุบันมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในห้องปฏิบัติการทางคลินิกสำหรับการตรวจทางโลหิตวิทยาตัวอย่างไขกระดูกและส่วนเนื้อเยื่อ.

เทคนิคการย้อม Giemsa นั้นมีประโยชน์อย่างมากสำหรับการศึกษาทางเซลล์วิทยาเนื่องจากช่วยให้สามารถสังเกตโครงสร้างเฉพาะของเซลล์ได้ เทคนิคนี้ทำให้ไซโตพลาสม่านิวเคลียสนิวคลีโอลีแวคิวโอลและแกรนูลของเซลล์สามารถแยกแยะโครมาตินได้อย่างละเอียด.

นอกจากนี้ยังสามารถตรวจจับการเปลี่ยนแปลงขนาดรูปร่างหรือสีของนิวเคลียสได้อย่างมีนัยสำคัญซึ่งเป็นไปได้ที่จะเห็นภาพการสูญเสียความสัมพันธ์ระหว่างนิวเคลียสและไซโตพลาสซึม.

ในทางตรงกันข้ามมันช่วยให้สามารถระบุเซลล์ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะในไขกระดูกและเลือดรอบข้างซึ่งเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการวินิจฉัยโรคที่ร้ายแรงเช่นโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาว นอกจากนี้ยังเป็นไปได้ที่จะตรวจจับฮีโมปาราไซต์แบคทีเรียและเซลล์ภายในเซลล์เชื้อราและอื่น ๆ.

ในเซลล์พันธุศาสตร์นั้นมีการใช้ค่อนข้างมากเนื่องจากเป็นไปได้ที่จะศึกษาการแบ่งเซลล์ของเซลล์.

ดัชนี

  • 1 รากฐานของสี Giemsa
  • 2 วัสดุ
    • 2.1 วัสดุสำหรับการเตรียมสารละลายแม่
    • 2.2 โหมดการเตรียมการของการแก้ปัญหาแม่
    • 2.3 วัสดุที่ใช้ในการเตรียมสารละลายบัฟเฟอร์
    • 2.4 การเตรียมสีย้อมขั้นสุดท้าย
    • 2.5 วัสดุเพิ่มเติมที่จำเป็นในการทำสี
  • 3 เทคนิค
    • 3.1 กระบวนการย้อมสี
  • 4 ยูทิลิตี้
    • 4.1 โลหิตวิทยา
    • 4.2 Mycology
    • 4.3 แบคทีเรียวิทยา
    • 4.4 ปรสิตวิทยา
    • 4.5 Cytology
    • 4.6 Cytogenetics
  • 5 การวิจัยแสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพของการย้อมสี Giemsa
  • 6 คำแนะนำสำหรับการย้อมสีที่ดี
  • 7 ข้อผิดพลาดทั่วไปในสีของ Giemsa
    • 7.1 การระบายสีสีน้ำเงินมาก
    • 7.2 การระบายสีสีชมพูมากเกินไป
    • 7.3 การตกตะกอนของรอยเปื้อน
    • 7.4 การมีอยู่ของสิ่งประดิษฐ์ทางสัณฐานวิทยา
  • 8 โหมดการจัดเก็บ
  • 9 อ้างอิง

รากฐานของสี Giemsa

สีย้อมประเภท Romanowsky มีพื้นฐานมาจากการใช้ความแตกต่างระหว่างกรดและสีย้อมพื้นฐานเพื่อให้ได้การย้อมสีของโครงสร้างพื้นฐานและกรดตามลำดับ ที่สามารถเห็นได้มีความสัมพันธ์ของสีย้อมกรดเพื่อย้อมโครงสร้างพื้นฐานและในทางกลับกัน.

สีย้อมพื้นฐานที่ใช้คือเมทิลีนบลูและอนุพันธ์ออกซิไดซ์ (Azure A และ Azure B) ในขณะที่สีย้อมกรดเป็นอีโอซิน.

โครงสร้างกรดของเซลล์คือกรดนิวคลีอิกแกรนูลของ basophils แบ่งกลุ่มอื่น ๆ ดังนั้นพวกเขาจะถูกย้อมด้วยเมทิลีนบลู.

ในความหมายเดียวกันนี้โครงสร้างพื้นฐานของเซลล์คือเฮโมโกลบินและแกรนูลบางอย่างเช่นที่มีอยู่ใน eosinophils แบบแบ่งกลุ่มอื่น ๆ สิ่งเหล่านี้จะถูกย้อมด้วยอีโอซิน.

ในทางกลับกันเนื่องจากความจริงที่ว่าเมทิลีนบลูและสีฟ้ามีลักษณะเป็นสีย้อม metachromatic พวกเขาสามารถให้เสียงตัวแปรไปยังโครงสร้างที่แตกต่างกันตามโหลดของ polyanions พวกเขามี.

นี่คือการรวมกันเชิงกลยุทธ์ของสีย้อมพื้นฐานและกรดสามารถพัฒนาสีได้หลากหลายตามลักษณะทางชีวเคมีของแต่ละโครงสร้างเดินผ่านสีฟ้าอ่อนฟ้าน้ำเงินม่วงและม่วงในกรณีของโครงสร้างที่เป็นกรด.

ในขณะที่การให้สีของอีซินมีความเสถียรมากขึ้นการสร้างสีระหว่างส้ม - แดงและแซลมอน.

วัสดุ

วัสดุสำหรับการเตรียมสารละลายแม่

การเตรียมสารละลายสต็อคต้องใช้การชั่งน้ำหนัก 600 มก. ของผง Giemsa ย้อมสี, วัดแอลกอฮอล์เมธิลปราศจากอะซิโตน 500 ซีซีและกลีเซอรีนเป็นกลาง 50 ซีซี.

โหมดการเตรียมการของการแก้ปัญหาแม่

วางผง Giemsa หนักลงในครก หากมีก้อนควรฉีดพ่น ต่อมาเพิ่มปริมาณกลีเซอรีนที่วัดได้และผสมให้เข้ากันดี ส่วนผสมที่ได้จะถูกเทลงในขวดอำพันที่สะอาดมาก.

กลีเซอรีนส่วนที่เหลือวางอยู่ในครก ผสมอีกครั้งเพื่อทำความสะอาดสีย้อมที่เหลือซึ่งติดอยู่กับผนังของปูนและเทลงในขวดเดียวกัน.

ขวดนี้ถูกปกคลุมและอุ้มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงในอ่างน้ำอุณหภูมิ55ºC ในขณะที่อาบน้ำ bain-marie ให้คนให้เข้ากันทุกครึ่งชั่วโมง.

หลังจากนั้นอนุญาตให้ส่วนผสมเย็นลงเพื่อวางแอลกอฮอล์ ก่อนหน้านี้ส่วนหนึ่งของแอลกอฮอล์ที่วัดได้จะถูกวางไว้ในครกเพื่อล้างสิ่งที่เหลือจากสีย้อมและจากนั้นจะถูกเพิ่มลงในส่วนผสมพร้อมกับแอลกอฮอล์ที่เหลือ.

การเตรียมตัวนี้ควรได้รับอนุญาตให้เติบโตอย่างน้อย 2 สัปดาห์ ส่วนที่ใช้ในการแก้ปัญหาแม่จะต้องกรอง.

เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของการเตรียมการขอแนะนำให้ส่งผ่านส่วนที่จะใช้งานอย่างต่อเนื่องไปยังขวดสีเหลืองขนาดเล็กที่มีหยด เติมเงินใหม่ทุกครั้งที่น้ำยาทดสอบหมด.

วัสดุในการเตรียมสารละลายบัฟเฟอร์

ในทางตรงกันข้ามสารละลายบัฟเฟอร์ที่ pH 7.2 นั้นถูกเตรียมไว้ดังนี้:

การชั่งโซเดียมโซเดียมฟอสเฟต (รัส) 6.77 กรัม (NaHPO)4) 2.59 กรัมโพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (KH)2PO4) และน้ำกลั่นสูงถึง 1,000 ซีซี.

การเตรียมสีย้อมขั้นสุดท้าย

สำหรับการเตรียมสารละลายย้อมสีขั้นสุดท้ายนั้นจะทำการวัดค่าสต็อคที่กรองแล้ว 2 ซีซีและผสมกับสารละลายบัฟเฟอร์ 6 ซีซี คนส่วนผสมให้เข้ากัน.

ความจริงที่เกี่ยวข้องที่ต้องคำนึงถึงคือเทคนิคในการเตรียมสีย้อมสามารถเปลี่ยนแปลงได้ตามบ้านในเชิงพาณิชย์.

วัสดุเพิ่มเติมที่จำเป็นในการทำสี

นอกเหนือจากวัสดุที่อธิบายไว้แล้วมันควรจะมีสะพานสี, หน้าจอน้ำหรือบัฟเฟอร์สำหรับซักผ้า, แผ่นสำหรับวัตถุหรือครอบคลุม, นาฬิกาจับเวลาเพื่อควบคุมเวลาการระบายสีและกระดาษซับหรือวัสดุบางอย่างที่สามารถใช้ในการแห้ง ( ผ้าโปร่งหรือผ้าฝ้าย).

เทคนิค

กระบวนการย้อมสี

1) ก่อนทำการระบายสีคุณจะต้องมีตัวอย่างแพร่กระจายบนสไลด์ที่สะอาด.

ตัวอย่างอาจเป็นเลือดไขกระดูกตัดเนื้อเยื่อเนื้อเยื่อหรือตัวอย่างช่องคลอดปากมดลูก ขอแนะนำให้ด้านนอกบางและมีการอบแห้ง 1 หรือ 2 ชั่วโมงก่อนทำการระบายสี.

2) แผ่นงานทั้งหมดที่คุณมีสีจะถูกวางไว้บนสะพานสี ทำงานในลำดับเดียวกันเสมอและระบุแต่ละแผ่นงานได้ดี.

3) วางเมธิลแอลกอฮอล์ 100% (เมทานอล) ลงบนสเมียร์และหยดทิ้งไว้ประมาณ 3 ถึง 5 นาทีเพื่อแก้ไขและขจัดตัวอย่าง.

4) ทิ้งเมทานอลที่มีอยู่ในแผ่นและอนุญาตให้อากาศแห้ง.

5) เมื่อแห้งให้วางสารละลายการย้อมสีขั้นสุดท้ายด้วยหยดจนครอบคลุมทั้งแผ่น ทิ้งไว้ 15 นาที ผู้เขียนบางคนแนะนำมากถึง 25 นาที ขึ้นอยู่กับอาคารพาณิชย์.

6) ระบายสีย้อมและล้าง smear ด้วยน้ำกลั่นหรือด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ 7.2.

7) บนกระดาษซับให้แผ่นที่แห้งในที่โล่งจัดเรียงในแนวตั้งด้วยความช่วยเหลือของการสนับสนุน.

8) เช็ดด้านหลังของสไลด์ด้วยผ้ากอซหรือสำลีชุบแอลกอฮอล์เพื่อลบสีย้อมที่เหลืออยู่.

ยูทิลิตี้

เทคนิคการย้อมสี Giemsa ถูกนำไปใช้ในหลาย ๆ ด้าน ได้แก่ : โลหิตวิทยา, เห็ดรา, แบคทีเรียวิทยา, ปรสิตวิทยา, เซลล์วิทยาและเซลล์วิทยา.

โลหิตวิทยา

มันเป็นยูทิลิตี้ที่พบบ่อยที่สุดที่กำหนดให้กับการย้อมสีนี้ ด้วยเราสามารถระบุเซลล์หนึ่งและทุก ๆ ที่อยู่ในตัวอย่างของไขกระดูกหรือเลือดรอบข้าง เช่นเดียวกับการประเมินจำนวนของแต่ละชุดความสามารถในการตรวจหาเม็ดเลือดขาวหรือเม็ดเลือดขาว, ภาวะเกล็ดเลือดต่ำ, ฯลฯ.

เพราะมันมีความไวต่อการระบุเซลล์ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะมันมีความเกี่ยวข้องในการวินิจฉัยโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวเฉียบพลันหรือเรื้อรัง นอกจากนี้ยังสามารถวินิจฉัยโรคโลหิตจางได้เช่นโรคเคียวเซลล์โรคเคียวเป็นต้น.

วิชาว่าด้วยเห็ดรา

ในบริเวณนี้เป็นเรื่องปกติที่จะใช้เพื่อค้นหา ฮีสโตพลาสม่าแคปซูล (intracellular dimorphic fungus) ในตัวอย่างเนื้อเยื่อ.

วิชาบัคเตรี

ในทางโลหิตวิทยาเปื้อนด้วย Giemsa สามารถตรวจจับได้ Borrelias sp ในผู้ป่วยที่มีโรคที่เรียกว่าไข้กำเริบ สไปโรเปสมีมากมายในเม็ดเลือดแดงในตัวอย่างที่ถ่ายที่ยอดไข้.

นอกจากนี้ยังเป็นไปได้ที่จะเห็นภาพแบคทีเรียในเซลล์เช่น Rickettsias sp และ Chlamydia trachomatis ในเซลล์ที่ติดเชื้อ.

ปรสิตวิทยา

ในสาขาวิชาปรสิตวิทยาการย้อมสี Giemsa ได้รับอนุญาตให้วินิจฉัยโรคพยาธิเช่นมาลาเรียโรค Chagas และ leishmaniasis.

ในสองคนแรกปรสิต พลาสโมเดียม sp และ Trypanosoma cruzi ตามลำดับพวกเขาสามารถมองเห็นได้ในเลือดรอบข้างของผู้ป่วยที่ติดเชื้อพวกเขาสามารถพบได้ในขั้นตอนต่าง ๆ ตามระยะที่เป็นโรค.

เพื่อปรับปรุงการค้นหาปรสิตในเลือดขอแนะนำให้ใช้ Giemsa stain ผสมกับสีย้อม May-Grünwald.

leishmaniasis ทางผิวหนังสามารถวินิจฉัยได้เมื่อประเมินตัวอย่างชิ้นเนื้อผิวหนังที่ย้อมด้วย Giemsa ซึ่งพบปรสิต.

เซลล์วิทยา

การย้อมสี Giemsa ยังใช้สำหรับการศึกษาเซลล์วิทยาของตัวอย่าง endocervical แม้ว่าจะไม่ใช่เทคนิคที่ใช้บ่อยที่สุดสำหรับจุดประสงค์นี้.

แต่ในกรณีที่ทรัพยากรขาดแคลนสามารถใช้งานได้ฟังก์ชั่นคล้ายกับที่เสนอโดยเทคนิค Papanicolaou และลดค่าใช้จ่าย อย่างไรก็ตามมันต้องใช้ความเชี่ยวชาญในส่วนของผู้ตรวจสอบ.

เซลล์พันธุศาสตร์

คุณลักษณะที่เกี่ยวข้องของการย้อมสี Giemsa คือความสามารถในการผูกติดอย่างแน่นหนากับภูมิภาคที่อุดมไปด้วย DNA adenines และ thymines สิ่งนี้ทำให้ DNA สามารถมองเห็นได้ในระหว่างการแบ่งเซลล์ในสภาวะต่าง ๆ ของการควบแน่น.

การศึกษาเหล่านี้มีความจำเป็นในการตรวจสอบความคลาดเคลื่อนของสีเช่นการทำซ้ำการลบหรือการเปลี่ยนตำแหน่งของภูมิภาคต่างๆของโครโมโซม.

งานวิจัยแสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพของการย้อมสี Giemsa

Cannova et al (2016), เปรียบเทียบ 3 เทคนิคการทำสีเพื่อการวินิจฉัยโรคผิวหนังเลสิมาเนีย.

สำหรับสิ่งนี้พวกเขาใช้ตัวอย่างที่ได้จากสัตว์ทดลองMesocrisetus auratus) การฉีดวัคซีนทดลองด้วย Leishmanias.

ผู้เขียนแสดงให้เห็นว่าการย้อมสี Giemsa ดีกว่า Pap-mart®และการย้อม Gaffney ดังนั้นพวกเขาจึงพิจารณาว่าคราบ Giemsa นั้นเหมาะที่จะวินิจฉัย leishmaniasis ทางผิวหนัง.

ผลลัพธ์ที่ยอดเยี่ยมที่ได้รับจากผู้เขียนนั้นมาจากความจริงที่ว่าการรวมกันของสีย้อมที่ทำขึ้นส่วนผสม Giemsa นำเสนอเงื่อนไขที่จำเป็นในการสร้างความคมชัดที่ดีทำให้เห็นความแตกต่างโครงสร้าง amastigote ทั้งภายใน.

เทคนิคอื่น ๆ (Pap-mart®และ Gaffney) ก็ทำเช่นนั้น แต่ในทางที่อ่อนแอกว่าและทำให้มองเห็นได้ยากขึ้น นั่นคือสาเหตุที่แนะนำให้ใช้ Giemsa stain ในการวินิจฉัยพยาธิสภาพของ leishmaniasis.

ในทำนองเดียวกันการศึกษาโดยRamírez et al (1994), ประเมินความถูกต้องของคราบ Giemsa และ Lendrum ในรอยเปื้อน conjunctival เพื่อระบุ Chlamydia trachomatis.

ผู้เขียนระบุว่าการย้อมสี Giemsa และ Ledrum มีความจำเพาะเหมือนกัน แต่ Giemsa มีความไวมากกว่า.

สิ่งนี้อธิบายได้ว่าเหตุใดการย้อมสี Giemsa ในปัจจุบันจึงถูกใช้บ่อยที่สุดสำหรับการวินิจฉัยการติดเชื้อหนองในเทียมโดยเฉพาะอย่างยิ่งหากมีทรัพยากรน้อย.

คำแนะนำสำหรับการย้อมสีที่ดี

ไม่ควรเร่งการอบแห้งแผ่น ต้องใช้เวลาอย่างรอบคอบในการอบแห้งในที่โล่ง ประมาณ 2 ชั่วโมง.

สีทันทีหลังจาก 2 ชั่วโมงเพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด.

เพื่อให้รอยเปื้อนที่ได้รับการแก้ไขและเปื้อนได้ดีขึ้นตัวอย่างจะต้องกระจายบนแผ่นในลักษณะที่ยังคงเป็นชั้นบางและสม่ำเสมอ.

ตัวอย่างเลือดที่ต้องการคือเส้นเลือดฝอยเนื่องจากสเมียร์ทำโดยตรงจากการหยดเลือดดังนั้นตัวอย่างจึงไม่มีสารเติมแต่งซึ่งช่วยบำรุงโครงสร้างเซลล์.

อย่างไรก็ตามหากมีการใช้เลือดดำ EDTA ควรใช้เป็นสารกันเลือดแข็งและไม่ heparin เนื่องจากหลังมักจะเปลี่ยนรูปเซลล์.

ข้อผิดพลาดทั่วไปในการระบายสีของ Giemsa

ในการฝึกทำสีนี้สามารถทำผิดพลาดได้ พวกเขาจะเห็นได้จากการเปลี่ยนแปลงอย่างฉับพลันในเฉดสีของโครงสร้าง.

สีฟ้ามาก

อาจเป็นเพราะ:

  • รอยเปื้อนหนามาก
  • เกินเวลาการย้อมสี
  • ซักน้อยเกินไป.
  • การใช้รีเอเจนต์ดีกว่าค่า pH เป็นกลาง (อัลคาไลน์).

ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้สีของโครงสร้างต่อไปนี้จะบิดเบี้ยวดังนั้นเม็ดเลือดแดงแทนที่จะตายสีชมพู - ปลาแซลมอนจะมีลักษณะสีเขียวเม็ดของ eosinophils ที่ควรย้อมอิฐสีแดงจะเปลี่ยนเป็นสีน้ำเงินหรือสีเทาและอื่น ๆ จะมี ความเบี่ยงเบนในโทนเสียงปกติ.

สีชมพูมากเกินไป

อาจเป็นเพราะ:

  • เวลาการย้อมสีไม่เพียงพอ.
  • ซักเป็นเวลานานหรือมากเกินไป.
  • การอบแห้งไม่ดี.
  • ใช้รีเอเจนต์ที่เป็นกรดมาก.

ในกรณีนี้โครงสร้างที่ปกติจะเป็นสีน้ำเงินจะมองไม่เห็นในขณะที่โครงสร้างที่เป็นสีชมพูจะมีโทนที่เกินจริงมาก.

ตัวอย่าง: เม็ดเลือดแดงจะมีสีแดงสดใสหรือสีส้มเข้ม, chromatin นิวเคลียร์จะมีลักษณะสีชมพูอ่อนและเม็ดของ eosinophils จะกลายเป็นสีแดงสดใส.

การปรากฏตัวของตะกอนในรอยเปื้อน

สาเหตุสามารถ:

  • ใช้แผ่นสกปรกหรือล้างไม่ดี.
  • อย่าปล่อยให้รอยเปื้อนแห้งดี.
  • ปล่อยให้น้ำยาตรึงอยู่นานเกินไป.
  • การซักไม่เพียงพอเมื่อสิ้นสุดการย้อมสี.
  • การกรองที่ไม่เพียงพอหรือการไม่กรองสีที่ใช้.

การปรากฏตัวของสิ่งประดิษฐ์ทางสัณฐานวิทยา

ลักษณะทางสัณฐานวิทยาอาจปรากฏในรอยเปื้อนทำให้ยากที่จะมองเห็นและตีความโครงสร้างที่ปรากฏ นี่คือเนื่องจาก:

  • ประเภทของสารกันเลือดแข็งที่ใช้เช่นเฮ.
  • ใช้กระดาษสกปรกที่เสียหายหรือมันเยิ้ม.

โหมดการจัดเก็บข้อมูล

หลังจากเตรียมสีย้อมควรเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง (15 - 25 °ซ) เพื่อป้องกันไม่ให้สีตกตะกอน จะต้องเก็บไว้ในภาชนะอำพันที่ปิดสนิท.

การอ้างอิง

  1. Cannova D, Brito E และ Simons M. การประเมินผลเทคนิคการทำสีเพื่อการวินิจฉัยโรคผิวหนัง Leishmaniasis. Salus.  2016; 20 (2): 24-29.
  2. PanReac Applichem ITW รีเอเจนต์ คราบ Giemsa รุ่น 2: JMBJUL17 CEIVD10ES Castellar del Vallés, สเปน.
  3. ขั้นตอนการย้อมสี Clark G. (1981), อันดับที่ 4 วิลเลียมส์ & วิลกินส์.
  4. เคมีประยุกต์คลินิก สีย้อม Giemsa สำหรับการวินิจฉัย ในหลอดทดลอง. ผู้จัดจำหน่าย: cromakit.es
  5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F และ Grazioso C. ความถูกต้องของ Giemsa และ Lendrum คราบในรอยเปื้อน conjunctival เพื่อระบุ Chlamydia trachomatis. Bol ของสนิทพานิม. ปี 1994 116 (3): 212-216.
  6. Casas-Rincon G. เห็ดราทั่วไป 2537 ได้ 2 เอ็ด Universidad เซ็นทรัลเดอเวเนซูเอลาฉบับห้องสมุด เวเนซุเอลาการากัส.
  7. "Giemsa เปื้อน" Wikipedia, สารานุกรมฟรี. 1 ก.ย. 2560, 01:02 UTC 6 ธ.ค. 2018, en.wikipedia.org.