รากฐานการทดสอบ Voges-Proskauer การเตรียมและการใช้งาน

การทดสอบ Voges-Proskauer เป็นการทดสอบทางชีวเคมีที่ใช้ในการระบุแบคทีเรียที่อยู่ในวงศ์ Enterobacteriaceae โดยเฉพาะอย่างยิ่งมันมีประโยชน์ในการแยกสายพันธุ์ของ Escherichia coli ของ Klebsiella และ Enterobacter, ท่ามกลางคนอื่น ๆ.

การทดสอบจะดำเนินการในสื่อการเลี้ยงของเหลวที่เรียกว่า methyl red-Voges Proskauer ซึ่งเป็นที่รู้จักกันดีโดยย่อ RM / VP สื่อนี้ประกอบด้วยโพลีเปปโตนบัฟเฟอร์, กลูโคส, ไดโพแทสเซียมฟอสเฟตและน้ำกลั่น.

สื่อ RM / VP ปัจจุบันคือการดัดแปลงของสื่อ Clark และ Lubs ซึ่ง แต่เดิมมีความเข้มข้นของ peptones และกลูโคสที่ต่ำกว่า ดังนั้นจึงมีการผลิตไฮโดรเจนไอออนที่น้อยกว่าซึ่งจำเป็นสำหรับปฏิกิริยาบวก Voges-Proskauer.

การทดสอบขึ้นอยู่กับความสามารถของจุลินทรีย์ในการใช้กลูโคสผ่านทางบิวทีลีนไกลคอลเส้นทางและสร้างผลิตภัณฑ์ที่เป็นกลางที่เรียกว่า acetoin เมื่อมีออกซิเจนและ pH เป็นด่าง.

ในสื่อ RM / VP นอกเหนือจากความสามารถในการเปิดเผยการทดสอบ Voges-Proskauer การทดสอบ methyl red ยังสามารถเปิดเผยได้.

ดัชนี

• 1 มูลนิธิ
  • 1.1 พื้นฐานของการทดสอบ Voges-Proskauer
  • 1.2 เกณฑ์ในการพัฒนาแบบทดสอบและตีความ
• 2 การเตรียมการ
  • 2.1 Medium RM / VP
  • 2.2 Voges A น้ำยา
  • 2.3 น้ำยา Voges B
• 3 ขั้นตอนของการทดสอบ Voges-Proskauer
  • 3.1 การพัฒนาแบบทดสอบ
• 4 ใช้
• 5 การควบคุมคุณภาพ
• 6 อ้างอิง

มูลนิธิ

พื้นฐานของการทดสอบ Voges-Proskauer

pluripeptonas ที่มีอยู่ในอาหารเลี้ยงเชื้อให้ความต้องการสารอาหารที่จำเป็นต่อการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย ในส่วนนี้กลูโคสเป็นสารประกอบหลัก แบคทีเรียจำนวนมากมีความสามารถในการเผาผลาญกลูโคสและสร้างกรด pyruvic.

กรด pyruvic เป็นจุดกึ่งกลางในการเผาผลาญกลูโคสและจากนั้นจุลินทรีย์แต่ละชนิดสามารถใช้เส้นทางที่แตกต่างกัน บางชนิดจะสร้างกรดผสมเช่นกรดแลคติกกรดอะซิติกกรดฟอร์มิกและกรดซัคคินิกและอื่น ๆ จะสร้างผลิตภัณฑ์ที่เป็นกลางเช่น 2,3-butanediol.

การทดสอบ Voges-Proskauer เผยให้เห็นความสามารถของจุลินทรีย์ในการสร้าง acetyl methyl carbinol (acetoin) ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ระดับกลางของ 2,3-butanediol ภายใต้สภาวะแอโรบิก.

Acetoin จะลดลงและรูปแบบ 2,3-butanediol แต่ปฏิกิริยานี้สามารถย้อนกลับได้ดังนั้นถ้า 2,3-butanediol จะถูกออกซิไดซ์ acetoin จะเกิดขึ้น ดังนั้นออกซิเจนจึงเป็นสิ่งจำเป็น.

Dipotassium phosphate เป็นบัฟเฟอร์ที่ทำให้สารผสมที่ค่าความเป็นกรดเป็นด่างเท่ากับ 6.9 ± 0.2.

พื้นฐานสำหรับการพัฒนาแบบทดสอบและการตีความ

ในการสาธิตปฏิกิริยาต้องทำการพัฒนาโดยใช้น้ำยาสองตัว (Barrit reagents) หรือที่รู้จักกันในชื่อ Voges A และ Voges B.

Voges A เป็นสารละลาย 5% ของα-naphthol และ Voges B เป็นการเตรียมโพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ 40% หากโพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ไม่สามารถใช้ได้ก็สามารถแทนที่ด้วยโซเดียมไฮดรอกไซด์ 40%.

Α-naphthol เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาที่จะเพิ่มความเข้มของสีของปฏิกิริยาซึ่งทำให้การทดสอบมีความไวมากขึ้น ต้องเพิ่มα-naphthol ก่อนเสมอกวนหลอดเพื่อให้สื่อสัมผัสกับออกซิเจน ด้วยวิธีนี้ acetoin ปัจจุบันถูกออกซิไดซ์ไปยัง diacetyl และ 2,3-butanediol ถูกออกซิไดซ์เพื่อสร้าง acetoin ส่งผ่านไปยัง diacetyl.

นี่คือวิธีที่α-naphthol จะจับกับ diacetyl ซึ่งจะเชื่อมโยงกับ guanidine nucleus ที่มีอยู่ใน arginine กรดอะมิโนซึ่งมาจาก pluripeptonas.

ในส่วนของมันโพแทสเซียมหรือโซเดียมไฮดรอกไซด์นั้นมีหน้าที่ดูดซับ CO₂ และทำปฏิกิริยากับ peptones ปฏิกิริยานี้ทำให้เกิดการก่อตัวของสีชมพูปลาแซลมอนมองเห็นได้ชัดเจนหลังจากเขย่าหลอดได้เป็นอย่างดี.

เพื่อให้สีเกิดขึ้นอย่างฉับพลันต้องผสม diacetyl, peptone และα-naphthol ในปริมาณที่ถูกต้อง หากสิ่งนี้ไม่เกิดขึ้นให้พักหลอดเป็นเวลา 15 นาทีก่อนการตีความ.

โดยปกติแล้วการทดสอบจะเป็นบวกหลังจาก 2 ถึง 5 นาทีเมื่อสามารถสังเกตเห็นสีชมพูอ่อน หากปล่อยทิ้งไว้ 30 นาทีถึง 1 ชั่วโมงความเข้มของสีจะสูงสุด (สีแดงเข้ม).

การทดสอบเชิงลบจะเห็นได้ชัดเมื่อน้ำซุปเป็นสีเหลือง หลังจาก 1 ชั่วโมงหากการทดสอบเป็นลบสีทองแดงสามารถเกิดขึ้นได้เนื่องจากปฏิกิริยาของโพแทสเซียมไฮดรอกไซด์บนα-naphthol.

การจัดเตรียม

ปานกลาง RM / VP

น้ำหนัก 17 กรัมของอาหารเลี้ยงเชื้อที่ปราศจากน้ำและละลายในน้ำกลั่นหนึ่งลิตร ให้ยืนเป็นเวลา 5 นาที ตั้งไฟให้เดือดจนละลายสนิท ทำหน้าที่ 3 ถึง 4 มล. ในหลอดและฆ่าเชื้อในหม้อนึ่งความดันที่ 121 ° C เป็นเวลา 15 นาที.

อาหารเลี้ยงเชื้อที่ถูกทำให้แห้งคือเนื้อสีเบจและสื่อที่เตรียมไว้นั้นเป็นสีเหลืองอ่อน.

ค่า pH สุดท้ายของสื่อคือ 6.9 ± 0.2.

Voges A น้ำยา

ชั่งน้ำหนักα-naphthol 5 กรัมและละลายในเอธิลแอลกอฮอล์ 50 มล. (แน่นอน) จากนั้นจึงเติมเอทิลแอลกอฮอล์ต่อไปจนถึง 100 มล.

น้ำยาทำปฏิกิริยาบี

น้ำหนักโพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ 40 กรัมและละลายในน้ำกลั่น 50 มิลลิลิตรในบีกเกอร์ ควรวางแก้วไว้ในอ่างน้ำเย็นเพื่อควบคุมอุณหภูมิเพราะเมื่อเวลาละลายการเตรียมจะเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว.

หลังจากสารละลายเย็นแล้วก็จะถูกส่งไปยังบอลลูนที่สำเร็จการศึกษาและนำขึ้นไป 100 มล. ด้วยน้ำกลั่น.

ขั้นตอนการทดสอบ Voges-Proskauer

ในการทำการทดสอบ Voges-Proskauer น้ำซุป RM / VP จะถูกฉีดยาด้วยเชื้อจุลินทรีย์ภายใต้การศึกษาจากวัฒนธรรมที่บริสุทธิ์ 18 ถึง 24 ชั่วโมง.

หัวเชื้อไม่ควรแน่นเกินไป มันถูกบ่มที่ 35-37 ° C เป็นเวลา 24 ถึง 48 ชั่วโมงถึงแม้ว่าบางครั้งจำเป็นต้องใช้เวลาในการฟักหลายวัน Cowan and Steel เชื่อว่า 5 วันเป็นเวลาบ่มเพาะขั้นต่ำที่จำเป็นในการตรวจหาเชื้อ Voges-Proskauer (VP) ทุกสายพันธุ์ของตระกูล Enterobacteriaceae.

การพัฒนาแบบทดสอบ

แยกส่วนลงตัว 1 มิลลิลิตรลงในหลอดแล้วทำตามขั้นตอนต่อไปนี้: วางน้ำยา Voges A 12 หยด (0.6 มล.) และ Voges B. 4 หยด (0.2 มิลลิลิตร) ผสมให้ผึ่งลมและปล่อยให้ยืน ประมาณ 5 - 10 นาทีก่อนแสดง อย่างไรก็ตามหากการทดสอบยังคงเป็นลบให้ยืนขึ้นและสังเกตหลอดหลังจาก 30 นาทีถึง 1 ชั่วโมง.

การปรากฏตัวของสีชมพู - แดงบ่งบอกว่าปฏิกิริยาของ Voges-Proskauer นั้นเป็นผลบวก ถ้าสื่อยังคงเป็นสีเหลืองปฏิกิริยาจะเป็นลบ.

การเพิ่มผู้พัฒนาตามลำดับและจำนวนที่ระบุนั้นเป็นสิ่งจำเป็นเพื่อหลีกเลี่ยงการปฏิเสธที่ผิดพลาด.

ใช้

การทดสอบ Voges-Proskauer มีประโยชน์ในการแยกความแตกต่างระหว่างสายพันธุ์ของ อี. โคไล ซึ่งเป็นค่าลบ VP ของสกุล Klebsiella, Enterobacter, Serratia และอื่น ๆ ซึ่งเป็นค่าบวก VP.

การควบคุมคุณภาพ

สายพันธุ์ควบคุมสามารถใช้ในการทดสอบคุณภาพของสื่อที่เตรียมไว้ Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, โพรทูส mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium และ Enterobacter cloacae ATCC 13047.

ผลลัพธ์ที่คาดหวังนั้นเป็นปฏิกิริยาเชิงบวกของ Voges-Proskauer เท่านั้น เค pneumoniae และ อี. Cloacae. ส่วนที่เหลือให้ปฏิกิริยาเชิงลบ.

การอ้างอิง

1. ห้องปฏิบัติการ Britania MR-VP ขนาดกลาง 2558 มีจำหน่ายที่: www.britanialab.com
2. Microkit Laboratories M-Ident Voges Proskauer 2014. พร้อมใช้งาน: http://www.medioscultivo.com
3. Mac Faddin J. (2003) การทดสอบทางชีวเคมีสำหรับการจำแนกแบคทีเรียที่มีความสำคัญทางคลินิก วันที่ 3 Panamericana บรรณาธิการ บัวโนสไอเรส อาร์เจนตินา.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009) การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยาของ Bailey & Scott 12 เอ็ด บรรณาธิการ Panamericana S.A. อาร์เจนตินา.
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004) การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยา วันที่ 5 บรรณาธิการ Panamericana S.A. อาร์เจนตินา.