มูลนิธิ Agar Müeller Hinton เตรียมและใช้งาน

Müeller Hinton agar มันเป็นสารอาหารที่เป็นของแข็งและไม่สามารถเลือกได้ซึ่งประกอบด้วยการแช่เนื้อเปปโตนกรดเคซีนในแป้งแป้งวุ้นและน้ำกลั่น สื่อนี้ช่วยให้การพัฒนาจุลินทรีย์ที่ยอดเยี่ยมของแบคทีเรียที่เติบโตอย่างรวดเร็วที่สุด.

มันถูกสร้างขึ้นครั้งแรกโดย John Howard Müellerและ Jane Hinton เพื่อแยกแบคทีเรียที่ต้องการสารอาหารเช่น Neisseria gonorrhoeae และ Neisseria meningitidis. อย่างไรก็ตามเนื่องจากคุณสมบัติของมันกลับกลายเป็นว่าเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการศึกษาความไวต่อยาปฏิชีวนะให้ผลลัพธ์ที่น่าเชื่อถือและทำซ้ำได้.

ด้วยเหตุผลนี้Müeller Hinton agar จึงเป็นสื่อทางวัฒนธรรมที่ได้รับการยอมรับจากสถาบันมาตรฐานห้องปฏิบัติการทางคลินิกและห้องปฏิบัติการ (CLSI) และคณะกรรมการยุโรปด้านการทดสอบความไวต่อยาต้านจุลชีพของยุโรปสำหรับการดำเนินการทดสอบความไวของยาต้านจุลชีพ บาวเออร์.

ดัชนี

• 1 มูลนิธิ
• 2 การเตรียมการ
• 3 ใช้
  • 3.1 เทคนิคการต้านจุลชีพ
  • 3.2 การวางกลยุทธ์ของแผ่นดิสก์บนMüeller Hinton agar
• 4 สาเหตุของผลลัพธ์ที่ผิดพลาด
• 5 ข้อ จำกัด
• 6 การควบคุมคุณภาพ
• 7 อ้างอิง

มูลนิธิ

เนื่องจากเป็นสารอาหารที่ไม่ผ่านการคัดเลือกจึงเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการเจริญเติบโตของแบคทีเรียที่ทำให้เกิดโรคส่วนใหญ่.

ในทางกลับกันองค์ประกอบที่เรียบง่ายของมันทำให้สารกระจายตัวได้ง่ายเป็นคุณลักษณะที่สำคัญสำหรับการทดสอบความไวโดยวิธีการกระจายดิสก์.

อีกลักษณะหนึ่งของมันคือมันมีสารยับยั้งในปริมาณต่ำซึ่งช่วยให้มีการประเมินซัลโฟนาไมด์, ไตรเมทโธปริมและเตตระไซคลินได้อย่างมีประสิทธิภาพ.

อย่างไรก็ตามมันจะต้องเป็นพาหะในใจว่าสื่อจะต้องตรงตามเงื่อนไขบางอย่างเพื่อให้แน่ใจว่าการทำงานที่เหมาะสมรวมถึง:

การปรับค่า PH, ความลึกของวุ้นและความเข้มข้นที่เพียงพอของไทมีน, ไทมีนีดี, แคลิฟอร์เนีย⁺⁺, มก.⁺⁺ และ Zn⁺⁺.

เราต้องรู้ด้วยว่าวิธีการนั้นเป็นมาตรฐานและดังนั้นจึงต้องปฏิบัติตามพารามิเตอร์ทั้งหมดเช่น:

ความเข้มข้นของหัวเชื้อ, ความเข้มข้นและการเก็บรักษาแผ่นยาปฏิชีวนะ, การวางจำนวนแผ่นดิสก์ที่เหมาะสมบนวุ้น, ระยะห่างระหว่างแผ่นดิสก์หนึ่งและอีกแผ่น, ตำแหน่งเชิงกลยุทธ์ของยาปฏิชีวนะบางชนิด, บรรยากาศ, อุณหภูมิและเวลาของ การบ่ม.

การจัดเตรียม

น้ำหนัก 37 กรัมของอาหารกลางMüeller Hinton ที่ถูกอบแห้งและละลายในน้ำกลั่น 1 ลิตร ตั้งไฟปานกลางขณะคนเพื่อช่วยละลาย ให้เดือดประมาณ 1 นาที.

ใช้หม้อนึ่งฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 121 ° C เป็นเวลา 15 นาที เมื่อนำออกจากหม้อนึ่งความดันควรวาง Fiola ไว้ในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 50 ° C เพื่อให้เย็นลง เท 25 ถึง 30 มล. ใส่จาน Petri ที่ปลอดเชื้อเส้นผ่านศูนย์กลาง 10 ซม.

แผ่นควรมีความหนาเฉลี่ย 4 มม. (เหมาะ) โดยมีช่วง 3-5 มม.

หากต้องการเตรียม agar blood โดยใช้ฐานวุ้นของMüeller Hinton จะต้องเทเลือดแกะที่ผ่านการฆ่าเชื้อและ defibrinated 5% ก่อนเสิร์ฟบนจาน.

ค่า pH สุดท้ายของสื่อควรอยู่ระหว่าง 7.2 ถึง 7.4.

ลงทุนและเก็บไว้ในตู้เย็นจนกระทั่งใช้ อนุญาตให้แผ่นใช้อุณหภูมิห้องก่อนใช้.

สีของสื่อที่เตรียมไว้คือสีเบจอ่อน.

การใช้งาน

มันถูกใช้เพื่อดำเนินการทดสอบความไวต่อยาปฏิชีวนะหรือยาปฏิชีวนะกับเชื้อที่ไม่เติบโตเร็วที่สุด.

หากวุ้นมีเลือดเสริมก็จะทำหน้าที่ต้านจุลชีพของจุลินทรีย์ที่ต้องการเช่น: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, ท่ามกลางคนอื่น ๆ มันยังถูกใช้เพื่อแยก Legionella pneumophila.

เทคนิค Antibiogram

ก่อนดำเนินการ antibiogram ต้องเตรียมสารละลายแบคทีเรียที่เทียบเท่ากับ 1.5 x 10⁸ เซลล์.

ในการทำเช่นนี้อาณานิคม 3 ถึง 4 จะถูกพรากไปจากวัฒนธรรมบริสุทธิ์และแขวนลอยในน้ำซุปถั่วเหลืองแบบไตรเซติเซสหรือในมิลเลอร์ฮินตันน้ำซุปบ่มเป็นเวลา 2 ถึง 6 ชั่วโมงและความเข้มข้นจะถูกปรับด้วยน้ำเกลือปลอดเชื้อเปรียบเทียบกับมาตรฐาน Mac Farland 0.5%.

หากพวกเขาต้องการจุลินทรีย์พวกมันสามารถแขวนอาณานิคมได้โดยตรงจนกว่าจะถึงความเข้มข้น 0.5% ของ Mac Farland ต่อจากนั้นจานMüeller Hinton ถูกหว่านด้วยไม้กวาดชุบด้วยสารละลายแบคทีเรียที่เตรียมไว้.

เมื่อต้องการทำสิ่งนี้ให้จุ่มก้านสำลีในสารละลายแล้วเอาของเหลวส่วนเกินออกโดยกดกับผนังของหลอด ทันทีหลังจากเช็ดล้างผ่านพื้นผิวทั้งหมดโดยไม่ทิ้งบริเวณที่ไม่มีการแตะต้องจากนั้นหมุนจานเล็กน้อยแล้วหว่านใหม่ การดำเนินการซ้ำแล้วซ้ำอีก 2 ครั้ง.

ปล่อยให้ยืนเป็นเวลา 10 นาทีแล้ววางแผ่นยาปฏิชีวนะด้วยคีมที่ผ่านการฆ่าเชื้อโดยเว้นระยะห่างระหว่าง 24 มม. หลังจากวางแผ่นดิสก์แต่ละแผ่นบน agar กดเบา ๆ ด้วยแคลมป์แต่ละอันเพื่อให้แน่ใจว่าพวกเขาจะปฏิบัติตามอย่างดี.

หลังจากกระบวนการจานจะกลับด้านและบ่มที่อุณหภูมิ 35-37 °ซเป็นเวลา 16 ถึง 18 ชั่วโมง ถ้าเป็นจุลินทรีย์ที่มีความต้องการสูงก็อาจต้องใช้ microaerophilia และถ้า antibiogram มีแผ่นออกซาซิลลินก็ควรอ่านได้ตลอด 24 ชั่วโมง.

ไม้บรรทัดถูกใช้เพื่อวัดเส้นผ่านศูนย์กลางของรัศมีแต่ละอัน ควรบันทึกผลลัพธ์เป็นมม. จากนั้นค่าที่ได้จะสัมพันธ์กับตารางจุดตัดที่เผยแพร่โดยคู่มือ CLSI ปัจจุบัน.

รายงานว่ามีความอ่อนไหว (S), กลาง (I) หรือความต้านทาน (R) ตาม แต่กรณี.

ยาปฏิชีวนะจะถูกเลือกตามจุลินทรีย์ที่แยกได้และชนิดของการติดเชื้อที่เกิดขึ้น.

บางครั้งการพิจารณาวางกลยุทธ์ของยาปฏิชีวนะควรแสดงรูปแบบการต้านทานฟีโนไทป์.

การวางกลยุทธ์ของแผ่นดิสก์บนMüeller Hinton agar

สำหรับ enterobacteria จะต้องวางดิสก์กรด clavulanic ไว้ด้านหน้า cephalosporins รุ่นที่ 3 และ 4 การขยับขยายรูปไข่บ่งบอกว่าสายพันธุ์นั้นเป็นผู้ผลิต beta-lactamases แบบขยายสเปกตรัม (ESBL) ซึ่งหมายความว่าผู้ป่วยไม่ควรได้รับการรักษาด้วย cephalosporin.

ใน Staphylococcus เป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องวางแผ่น erythromycin หรือ azithromycin ไว้ด้านหน้าแผ่น clindamycin (D-test).

รัศมีต้านทานใน erythromycin และแบนราบในรัศมี clindamycin บ่งชี้ว่าสายพันธุ์นั้นมีความต้านทานต่อ clindamycin สายพันธุ์ (RIC) ที่ไม่สามารถต้านทานได้ ซึ่งหมายความว่าการรักษาด้วย clindamycin จะไม่ได้ผล.

สำหรับการค้นหาสายพันธุ์ AMP C ที่ไม่สามารถเหนี่ยวนำได้ใน Enterobacteriaceae และแบคทีเรียแกรมลบบางชนิดที่ไม่ผ่านการหมักแผ่นดิสก์ของ ceftazidime, cefoxitin หรือ piperacillin tazobactan กำลังเผชิญหน้ากับดิสก์ imipenem ที่ระยะ 27 มม..

รัศมีที่แบนหนึ่งในแผ่นดิสก์หันหน้าไปทาง imipenem บ่งชี้ว่ามี AMP C ที่เหนี่ยวนำไม่ได้.

สำหรับการค้นหาแอมป์ constitutive แผ่นดิสก์ Cloxacillin 500 μgต้องเผชิญกับ ceftazidime (30 μg) และ cefotaxime (30 μg) ที่ระยะ 25 มม. รัศมีที่กว้างขึ้นในหนึ่งใน cephalosporins บ่งบอกถึงความเป็นบวก.

แผ่นดิสก์ Cloxacillin สามารถถูกแทนที่ด้วยแผ่นกรองขนาด 9 มม. ของกระดาษกรอง Whatman No. 6 ซึ่งชุบด้วยกรดฟีนิลโบรอน (400 ไมโครกรัม) ด้วยระยะห่าง 18 มม. มันถูกตีความเช่นเดียวกับก่อนหน้านี้.

ในที่สุดเพื่อตรวจสอบการผลิตของ metallo-beta-lactamases โดยเฉพาะใน Pseudomonas aeruginosa, ดิสก์ที่ชุบด้วยกรดอะมิโน 10 μlขนาด 10 μl (EDTA 750 μg) และกรด thioglycolic (SMA 300 μg) ซึ่งใช้ดิสก์ imipenem และ meropenem ที่ระยะ 15 มม..

การทดสอบเป็นบวกหากมีการเพิ่มขนาดของ imipenem หรือ meropenem รัศมีไปทางดิสก์ EDTA / SMA ผลลัพธ์นี้จะต้องได้รับการยืนยันจากการทดสอบ Hodge ที่แก้ไข.

วิธีนี้ประกอบไปด้วย Escherichia coli ATCC 25922 บนจานMüeller Hinton มีการวางดิสก์ imipenem ไว้ที่กึ่งกลางของแผ่นจากนั้นจะทำการเป่าขลุ่ยจากดิสก์ไปทางรอบนอกด้วยความตึงของ P. aeruginosa พิรุธ คุณสามารถทดสอบได้ถึง 4 สายพันธุ์ต่อแผ่น.

การทดสอบจะเป็นบวกหากมีการบิดเบือนโซนของ imipenem halo รอบ ๆ Stria.

สาเหตุของผลลัพธ์ที่ผิดพลาด

-แผ่นยาปฏิชีวนะที่ได้รับการดูแลรักษาไม่ดีสามารถสร้างความต้านทานปลอมได้ ตัวอย่างเช่นดิสก์ออกซาซิลลินมีความเสี่ยงต่อการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ.

-ค่า pH ของสื่อด้านล่างที่ระบุ (กรด) จะสร้างรัศมีที่เล็กกว่าใน aminoglycosides และ macrolides (เสี่ยงต่อการต้านทานเท็จ) และขนาดใหญ่ขึ้นในเพนนิซิลิน, tetracycline และ novobiocin (เสี่ยงต่อการสัมผัสที่ผิดพลาด).

-หากค่า pH สูงกว่าค่าที่ระบุ (อัลคาไลน์) ผลกระทบที่อธิบายไว้ข้างต้นจะกลับด้าน.

-สื่อที่มีความเข้มข้นของไทมมีนสูงและไทมดิดีนจะมีผลลดการยับยั้ง Halonamides และ trimethoprim.

-ความเข้มข้นสูงของแคลเซียมและแมกนีเซียมผลิตความต้านทานเท็จของ aminoglycosides, polymyxin B และ tetracyclines กับสายพันธุ์ของ Pseudomonas aeruginosa.

-ความเข้มข้นต่ำของแคลเซียมและแมกนีเซียมผลิตความไวเท็จของ aminoglycosides, polymyxin B และ tetracyclines กับสายพันธุ์ของ Pseudomonas aeruginosa.

-การปรากฏตัวของสังกะสีส่งผลกระทบต่อผลลัพธ์ของแผ่น carbapenems (imipenem, meropenem และ ertapenem).

-ความหนาของสื่อที่ต่ำกว่า 3 มม. จะให้ผลลัพธ์ความไวเท็จในขณะที่ความหนาที่สูงกว่า 5 จะให้ความต้านทานที่ผิดพลาด.

-การเคลื่อนที่ของแผ่นดิสก์ใน antibiogram จะให้รัศมีที่ผิดรูปไปเนื่องจากการออกฤทธิ์ของยาปฏิชีวนะทันที.

- หัวเชื้อที่อ่อนแอมากมีผลต่อผลลัพธ์เนื่องจากจะไม่มีการเจริญเติบโตที่สม่ำเสมอหรือไหลมารวมกันในวุ้นซึ่งเป็นเงื่อนไขที่จำเป็นในการวัดโซนการยับยั้งนอกเหนือจากข้อเท็จจริงที่ว่ารัศมีสามารถให้ใหญ่กว่าปกติ.

-inocula ที่บรรทุกมากเกินไปสามารถทำให้รัศมีมีขนาดเล็กกว่าปกติ.

-การไม่เคารพระยะห่างระหว่างแผ่นดิสก์ทำให้รัศมีหนึ่งซ้อนทับกันและไม่สามารถอ่านได้อย่างถูกต้อง.

-บ่มเพาะกับ CO₂ เพิ่มขนาดของรัศมีของ tetracycline และ methicillin ดิสก์.

-การบ่มที่อุณหภูมิต่ำกว่า 35 ° C ก่อให้เกิดรัศมีที่ใหญ่กว่า.

-การเติมเลือดจะลดขนาดของซัลโฟนาไมด์.

การ จำกัด

ความไวของยาปฏิชีวนะแสดงให้เห็นใน antibiogram ต่อต้านจุลินทรีย์ (ในหลอดทดลอง) ไม่รับประกันว่าจะใช้งานได้ ในร่างกาย.

การควบคุมคุณภาพ

หากต้องการทราบว่าสื่อที่มีปริมาณไทมีนในปริมาณที่เหมาะสมควรมีการหว่านความเครียดหรือไม่ ของ Enterococcus faecalis ATCC 29212 และทดสอบความอ่อนไหวต่อ trimethoprim sulfamethoxazole (SXT) ควรให้รัศมีเท่ากับหรือ> 20 มม..

การอ้างอิง

1. "Agar Müller-Hinton." Wikipedia, สารานุกรมฟรี. 16 พ.ย. 2018, 12:23 UTC 27 ม.ค. 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009) การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยาของ Bailey & Scott 12 เอ็ด บรรณาธิการ Panamericana S.A. อาร์เจนตินา.
3. Cona E. เงื่อนไขสำหรับการศึกษาความอ่อนไหวที่ดีโดยการทดสอบการแพร่ของวุ้น. เรฟชิลติดเชื้อ, ปี 2002 19 (2): 77-81
4. ห้องปฏิบัติการ Difco Francisco Soria Melguizo วุ้นมิลเลอร์ฮินตันที่มีเลือดแกะ 5% 2552 มีจำหน่ายที่: http://f-soria.es
5. ห้องปฏิบัติการ BD Müeller Hinton II Agar 2017. มีจำหน่ายที่: .bd.com
6. ห้องปฏิบัติการ Britania Müeller Hinton agar 2558 มีจำหน่ายที่: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004) การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยา วันที่ 5 บรรณาธิการ Panamericana S.A. อาร์เจนตินา.
8. Martínez-Rojas D. Betalactamas เป็นชนิด AmpC: ทั่วไปและวิธีการตรวจจับฟีโนไทป์. รายได้ Soc. Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83 มีจำหน่ายที่: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. การตรวจฟีโนไทป์ของ metallobetalactamases ในไอโซเลททางคลินิก Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121 มีจำหน่ายที่: scielo.org.