ลำดับเบส Maxam-Gilbert, Sanger, ตัวอย่าง

การหาลำดับดีเอ็นเอ (deoxyribonucleic acid) เป็นกระบวนการที่ดำเนินการในห้องปฏิบัติการอณูชีววิทยาที่ช่วยให้ทราบลำดับของนิวคลีโอไทด์ในสารพันธุกรรมที่น่าสนใจ นอกจากนี้ยังสามารถเปิดเผยลำดับของ RNA (กรดริบอนนิวคลีอิก).

เทคนิคนี้เป็นสิ่งที่ขาดไม่ได้สำหรับการพัฒนาวิทยาศาสตร์ชีวภาพ นอกจากนี้ยังใช้กับสาขาความรู้อื่น ๆ เช่นการวินิจฉัยทางการแพทย์และการตรวจสอบทางนิติวิทยาศาสตร์เป็นต้น.

ก่อนหน้านี้การจัดลำดับของดีเอ็นเอถือเป็นกิจกรรมที่ช้าและมีราคาแพงซึ่งอนุญาตการระบุคู่เบสเพียงไม่กี่คู่ในโอลิโกนิวคลีโอไทด์.

ทุกวันนี้ด้วยความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์ทำให้การจัดลำดับดีเอ็นเอเป็นกิจวัตรประจำวันในห้องทดลองหลายแห่งทั่วโลกด้วยการสนับสนุนการวิจัยเกือบ 50 ปีในสาขานี้ สำหรับความยาวของโซ่คุณสามารถเรียงลำดับคู่ฐานได้มากถึงล้านคู่ในเวลาอันสั้น.

ในการทำเช่นนั้นมีเทคนิคมากมายที่พัฒนาขึ้นซึ่งมีราคาและความแม่นยำแตกต่างกันไป ในบทความนี้เราจะอธิบายเทคนิคทั้งแบบคลาสสิกและสมัยใหม่โดยแต่ละข้อมีข้อดีและข้อเสีย.

จนถึงตอนนี้เทคนิคการหาลำดับเบสทำให้ได้ลำดับของจีโนมที่สมบูรณ์ตั้งแต่โปรคาริโอตและยีสต์ขนาดเล็กไปจนถึงจีโนมมนุษย์.

ดัชนี

• 1 โครงสร้างของ DNA
• 2 ประวัติศาสตร์
• 3 Sanger method
  • 3.1 องค์ประกอบหลักของปฏิกิริยา
  • 3.2 การอ่านผลลัพธ์
• 4 การเรียงลำดับอัตโนมัติ
• 5 ลำดับ Maxam-Gilbert
  • 5.1 ขั้นตอน
  • 5.2 การอ่านผลลัพธ์
• 6 การจัดลำดับขนาดใหญ่
  • 6.1 Pyrosequencing
  • 6.2 การจัดลำดับโดยการสังเคราะห์
  • 6.3 การเรียงลำดับโดย ligation
  • 6.4 Sequencing Ion Torrent
• 7 ตัวอย่าง
  • 7.1 การหาลำดับจีโนมของมนุษย์
• 8 ความสำคัญและการใช้งาน
• 9 อ้างอิง

โครงสร้างของดีเอ็นเอ

เพื่อให้เข้าใจถึงวิธีการและเทคนิคที่ใช้ในการหาลำดับดีเอ็นเอจำเป็นต้องรู้ถึงลักษณะสำคัญบางประการของโครงสร้างและองค์ประกอบของโมเลกุล.

DNA เป็นสารชีวโมเลกุลที่พบได้ในสิ่งมีชีวิตทุกชนิดตั้งแต่แบคทีเรียไปจนถึงสัตว์น้ำขนาดใหญ่ ออร์แกเนลล์ - เหมือนไมโทคอนเดรียและคลอโรพลาสต์ - มีโมเลกุลดีเอ็นเอวงกลมอยู่ข้างใน แม้ในไวรัสบางชนิดสารพันธุกรรมที่พบก็คือ DNA.

โครงสร้างดีเอ็นเอเป็นชุดของนิวคลีโอไทด์ แต่ละอันถูกรวมเข้าด้วยกันโดยมีคาร์โบไฮเดรตฐานไนโตรเจน (A, T, C หรือ G) และกลุ่มฟอสเฟต เป้าหมายของการจัดลำดับดีเอ็นเอคือการเปิดเผยลำดับการพบฐานไนโตรเจนทั้งสี่ในลำดับ.

ประวัติศาสตร์

ในช่วงกลางทศวรรษที่ 1950 นักวิจัยวัตสันและคริกได้อธิบายโครงสร้างของดีเอ็นเอโดยใช้เทคนิคทางคริสต์ศาสนา อย่างไรก็ตามไม่มีนักวิจัยเหล่านี้สามารถหาวิธีที่จะเปิดเผยลำดับ.

แม้ว่าจะมีรุ่นก่อน ๆ แต่เหตุการณ์ที่สำคัญที่สุดคือการสร้างวิธีการของแซงเจอร์ในปี 1977 เฟรดเดอริกแซงเจอร์พ่อของวิธีการนี้เป็นนักชีวเคมีชาวอังกฤษซึ่งได้รับรางวัลโนเบลสองรางวัลจากผลงานมหาศาลของเขา.

เทคนิคนี้เป็นที่รู้จักกันในวรรณคดีว่า "การเลิกห่วงโซ่" หรือ dideoxynucleotides ต่อไปเราจะอธิบายหลักการของเทคนิคนี้และผู้ที่ได้รับการพัฒนาบนพื้นฐานการปรับปรุงและนวัตกรรมของสิ่งนี้.

วิธีการของแซงเจอร์

การพัฒนาวิธีการของแซงเจอร์เป็นเหตุการณ์สำคัญในชีววิทยาโมเลกุล มันเกี่ยวข้องกับส่วนประกอบพื้นฐานของกระบวนการจำลองดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นตามปกติในเซลล์ แต่โดยการเพิ่มองค์ประกอบพิเศษ: dideoxynucleotides.

ส่วนประกอบหลักของปฏิกิริยา

- DNA polymerase: เอนไซม์ DNA polymerase เป็นองค์ประกอบสำคัญของกระบวนการ โมเลกุลนี้มีส่วนร่วมในการจำลองแบบของ DNA strand และบทบาทของมันคือการสังเคราะห์ของสายโซ่ใหม่จับคู่กับ Deoxyribonucleotides triphosphate กับสารเสริม.

โปรดจำไว้ว่าใน DNA ไทมีน (T) จับคู่กับอะดีนีน (A) โดยใช้พันธะไฮโดรเจนสองพันธะในขณะที่ไซโตซีน (C) ทำกับ guanine (G) โดยสะพานทั้งสาม.

- นิวคลีโอไทด์: การเรียงลำดับแซงเจอร์เกี่ยวข้องกับนิวคลีโอไทด์สองประเภท, 2'-deoxynucleotides (ตัวย่อเป็น dATP, dGTP, dCTP และ dTTP) และสี่ dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP และ ddTTP).

แม้ว่า dideoxynucleotides จะคล้ายกับโมโนเมอร์ซึ่งโดยปกติจะถูกรวมเข้าไปใน DNA แต่พวกมันขาดกลุ่ม -OH ในโครงสร้างของมัน ทำให้เป็นไปไม่ได้ที่จะเพิ่มนิวคลีโอไทด์ใหม่ในโซ่.

ดังนั้นเมื่อมีการเพิ่มนิวคลีโอไทด์พิเศษ - ในวิธีสุ่มอย่างสมบูรณ์ - ต่อสายโซ่ในการสร้างการสังเคราะห์จึงเป็นอัมพาต ด้วยวิธีนี้ในตอนท้ายของการเกิดปฏิกิริยาจะมีโซ่ที่มีขนาดต่างกันแต่ละอันที่ปฏิกิริยาหยุดลงที่จุดที่แตกต่างกัน.

ทดลองเตรียมสี่การทดลอง แต่ละอันประกอบด้วย DNA ที่สกัดจากตัวอย่างชีวภาพที่น่าสนใจนิวคลีโอไทด์ปกติและนิวคลีโอไทด์พิเศษหนึ่งในสี่ชนิด หรือนิวคลีโอไทด์พิเศษถูกทำเครื่องหมายด้วยตัวทำเครื่องหมายฟลูออเรสเซนต์บางประเภท.

การอ่านผลลัพธ์

ขั้นตอนแรกคือการแยกแต่ละโซ่สังเคราะห์ตามขนาดของพวกเขา บางคนจะยาวกว่าคนอื่น ๆ ขึ้นอยู่กับว่าฐานพิเศษถูกรวมอยู่ที่ไหน.

มีเทคนิคทางชีวเคมีที่แตกต่างกันที่อนุญาตให้มีการแยกส่วนประกอบของส่วนผสมโดยใช้ขนาดเป็นคุณสมบัติการเลือกปฏิบัติ ในวิธีการแซงเจอร์โซ่ที่แตกต่างกันจะถูกคั่นด้วยอิเล็ก ในสายพันธุ์ที่ซับซ้อนที่สุดของเทคนิคนี้ใช้อิเล็กโทรไลต์เส้นเลือดฝอย.

ดังนั้นเส้นที่ยาวกว่าจึงเคลื่อนที่น้อยกว่าสายพันธุ์ที่สั้นกว่า จากนั้นระบบนี้จะผ่านตัวอ่านที่จดจำเครื่องหมายที่อยู่ในแต่ละไดด์ออกซินนิวคลีโอไทด์ ด้วยวิธีนี้ลำดับของลำดับสามารถทราบได้.

เทคนิค "รุ่นแรก" นี้สามารถอ่านชิ้นส่วนดีเอ็นเอไม่เกิน 1 กิโลกรัม ในปัจจุบันวิธีการของแซงเจอร์ถูกนำมาใช้ในห้องปฏิบัติการหลายแห่งโดยทั่วไปในรูปแบบที่ทันสมัย นอกจากนี้ยังใช้ในการยืนยันผลลัพธ์ที่ได้ด้วยเทคนิคที่ซับซ้อนที่สุด - แต่แม่นยำน้อยกว่า.

การจัดลำดับอัตโนมัติ

เมื่อจำเป็นต้องมีการจัดลำดับขนาดใหญ่กระบวนการจะถูกเร่งด้วยระบบอัตโนมัติ นี่เป็นรูปแบบของวิธีการยกเลิกเชนเชนเจอร์ซึ่งไพรเมอร์ถูกทำเครื่องหมายด้วยผลิตภัณฑ์ฟลูออเรสเซนต์เพื่อแยกแยะความแตกต่าง.

ต่อจากนั้นปฏิกิริยาของผลิตภัณฑ์จะถูกเรียกใช้ในอิเล็กโทรโฟเรซิสทั้งหมดนี้อยู่ในเลนเดียว เมื่อแต่ละส่วนแยกออกจากส่วนสุดท้ายของเจลจะถูกระบุอย่างรวดเร็วโดยฉลากเรืองแสงโดยมีข้อผิดพลาดที่ล้อมรอบ 1%.

ระบบที่ทันสมัยที่สุดมีระบบของหลอดเส้นเลือดฝอยสูงถึง 96 หลอดซึ่งดำเนินการโดยคอมพิวเตอร์ควบคู่ไปกับหุ่นยนต์ นั่นคือสามารถเก็บตัวอย่างดีเอ็นเอ 96 ตัวอย่างได้พร้อมกัน ดังนั้นกระบวนการที่เกี่ยวข้องกับอิเล็กโตรโฟรีซิสและการวิเคราะห์ผลลัพธ์เป็นไปโดยอัตโนมัติอย่างสมบูรณ์.

ในหนึ่งวันระบบเหล่านี้สามารถเรียงลำดับได้สูงถึง 550,000 เบส ในระหว่างกระบวนการทำงานของมนุษย์ไม่จำเป็นต้องใช้เวลาประมาณ 15 นาทีเพื่อเริ่มวิธีการ.

การจัดลำดับโดย Maxam-Gilbert

ในเวลาเดียวกันกับที่ Sanger ตีพิมพ์ผลงานของเขานักวิจัยสองคนชื่อ Allan Maxan และ Walter Gilbert พยายามพัฒนาวิธีอื่นเพื่อให้ได้ลำดับ DNA วิธีการดังกล่าวได้รับความนิยมในเวลานั้น แต่หลังจากนั้นก็ถูกแทนที่ด้วยการปรับปรุงวิธีการของแซงเจอร์.

ตรงกันข้ามกับวิธีของแซงเจอร์การเรียงลำดับของ Maxan และ Gilbert (หรือการจัดลำดับทางเคมีตามที่ทราบกันดี) ไม่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาลูกผสม วิธีการประกอบด้วยการทำเครื่องหมายด้วยตัวแทนปฏิกิริยาที่ปลายด้านหนึ่งตามด้วยกระบวนการทำให้บริสุทธิ์.

หนึ่งในด้านลบของเทคนิคนี้อยู่ในความซับซ้อนอย่างมากและในการใช้สารเคมีที่เป็นอันตรายต่อผู้ใช้ การสลายทางเคมีเกิดจากการใช้ DMS กรดฟอร์มิกไฮดราซีนและไฮดราซีนด้วยเกลือ.

กระบวนการ

โพรโทคอลเริ่มต้นด้วยการติดฉลากที่ปลาย 5 'ของเกลียวด้วย phosphor marker 32 จากนั้นจะมีการดัดแปลงทางเคมีของฐานไนโตรเจนเกิดขึ้นและถูกแยกออก ในที่สุดการแบ่งของภูมิภาค abasic เกิดขึ้น.

ก่อนอื่นโซ่ที่จะเรียงลำดับจะถูกทำให้สั้นลงเป็นเซ็กเมนต์ที่เล็กกว่า ขั้นตอนนี้จะดำเนินการกับเอนไซม์ จำกัด ซึ่งส่งผลให้เกิดความสุดขั้ว.

ต่อไปจะทำปฏิกิริยากับอัลคาไลน์ฟอสฟาเตสซึ่งมีจุดประสงค์เพื่อกำจัดกลุ่มฟอสเฟต ดังนั้นไคเนส polynucleotide จึงสามารถใช้ในการติดฉลาก.

โซ่ถูกทำลายสภาพ (ทั้งสองเส้นเปิด) จากนั้นเราดำเนินการต่อเพื่อใช้สารเคมี ปฏิกิริยาความแตกแยกเหล่านี้เกิดขึ้นในลักษณะการควบคุมและชนิดของพันธะใดที่ถูกทำลายโดยสารเคมีแต่ละชนิด.

การอ่านผลลัพธ์

ในวิธีการแซงเจอร์การอ่านผลเกี่ยวข้องกับการแยกตามขนาดของโซ่ที่ได้รับในระบบอิเล็กโตรโฟรีซิส ระบบที่ประกอบด้วยโพลีอะคริลาไมด์ช่วยให้ได้ความละเอียดที่เพียงพอสำหรับการอ่านเจล.

การจัดลำดับขนาดใหญ่

การจัดลำดับขนาดใหญ่บนโลกไซเบอร์เป็นชุดของวิธีการใหม่โดยย่อว่า NGS จากภาษาอังกฤษ "การจัดลำดับยุคใหม่ ".

วิธีการจัดทำรายการเป็น NGS ต้องการขั้นตอนก่อนหน้าของการขยาย DNA (พวกเขาไม่ทำงานกับโมเลกุลเดียว) นอกจากนี้แพลตฟอร์มที่ใช้แตกต่างกันไปอย่างกว้างขวาง หลักการของวิธีการที่ได้รับความนิยมมากที่สุดจะอธิบายไว้ด้านล่าง:

pyrosequencing

มันเกี่ยวข้องกับการตรวจสอบการปล่อยไพโรฟอสเฟตซึ่งเกิดขึ้นทุกครั้งที่มีการเพิ่มนิวคลีโอไทด์ใหม่ในสายดีเอ็นเอ ระบบเอนไซม์จะถูกรวมเข้าด้วยกันเพื่อให้การปล่อยแสง (ซึ่งตรวจพบโดยกล้อง) เกิดขึ้นทุกครั้งที่รวมนิวคลีโอไทด์ใหม่เข้าด้วยกัน.

กระบวนการเริ่มต้นด้วยการฟักไข่แยกของแต่ละฐานไนโตรเจนเพื่อตรวจสอบว่ามีการปล่อยแสงหรือไม่ Pyrosequencing สามารถอ่านค่าของเส้นยาว แต่อัตราความผิดพลาดที่พบนั้นสูง.

การเรียงลำดับโดยการสังเคราะห์

เรื่องนี้เกี่ยวข้องกับการรวมตัวกันของนิวคลีโอไทด์ที่มีป้ายกำกับ ส่วนประกอบของฟลูออเรสเซนต์เหล่านี้จะถูกชะล้างและนิวคลีโอไทด์ที่รวมเข้าด้วยกัน จากนั้นการติดฉลากนิวคลีโอไทด์ก็จะหมดไปและการสังเคราะห์ของเส้นเกลียวสามารถดำเนินต่อไปได้ ในขั้นตอนต่อไปนิวคลีโอไทด์ที่มีป้ายกำกับจะถูกรวมเข้าด้วยกันและขั้นตอนดังกล่าวจะถูกทำซ้ำ.

ข้อเสียเปรียบอย่างหนึ่งของเทคนิคนี้เกิดขึ้นเมื่อตัวทำเครื่องหมายเรืองแสงไม่ถูกกำจัดออกจนหมด การปล่อยเหล่านี้สร้างข้อผิดพลาดพื้นหลังทำให้เกิดข้อผิดพลาดที่สำคัญ.

การเรียงลำดับโดย ligation

เทคนิคนี้แตกต่างจากคนอื่น ๆ เพราะมันไม่ได้ใช้ DNA polymerase เอ็นไซม์สำคัญสำหรับวิธีการนี้คือ ligase แทน นี่คือชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ใช้ติดฉลากเรืองแสงถูกผูกไว้กับเอนไซม์และตรวจพบ.

ปัญหาที่ใหญ่ที่สุดของเทคนิคนี้คือความยาวของแฟรกเมนต์สั้นมากที่สามารถประมวลผลได้.

Ion Sequencing Torrent

เทคนิคนี้ขึ้นอยู่กับการวัดค่าของไอออน H⁺ ซึ่งจะถูกปล่อยออกทุกครั้งที่มีนิวคลีโอไทด์ใหม่รวมอยู่ หลักการค่อนข้างคล้ายกับ pyrosequencing แต่ราคาถูกกว่ามาก.

ตัวอย่าง

การหาลำดับจีโนมของมนุษย์

การเรียงลำดับจีโนมของมนุษย์เป็นหนึ่งในความท้าทายที่มีแนวโน้มมากที่สุดในชีววิทยาเช่นเดียวกับการเป็นหนึ่งในการแข่งขันที่ได้รับรางวัลมากที่สุดในประวัติศาสตร์ของวิทยาศาสตร์ ในความเป็นจริงสำหรับนักวิทยาศาสตร์ที่เกี่ยวข้องในโครงการการหาลำดับจีโนมกลายเป็นการแข่งขัน.

ในปี 1990 เขาเริ่มสิ่งที่เรียกว่า "โครงการจีโนมมนุษย์" นำโดยนักวิทยาศาสตร์ที่มีชื่อเสียงผู้ชนะของรางวัลโนเบลเจมส์วัตสัน หลังจากผ่านไปหนึ่งปีในปี 1991 Venter ได้ท้าทายการตีวัตสันและลำดับจีโนมต่อหน้าเขา อย่างไรก็ตามในปี 1992 วัตสันเกษียณและคำสั่งถูกยึดครองโดยนักวิจัยคนอื่น.

ในปีพ. ศ. 2538 Venter ได้ประกาศความสำเร็จของเขาในการหาลำดับจีโนมของแบคทีเรียด้วยวิธีการหาลำดับแบบสุ่ม ในทำนองเดียวกันทีมตรงข้ามประกาศในอีกหนึ่งปีต่อมาการเรียงลำดับของจีโนมยีสต์.

ในปี พ.ศ. 2543 การแข่งขันสิ้นสุดลง ทั้งสอง บริษัท ได้ตีพิมพ์ผลการศึกษาเบื้องต้นของจีโนมที่สมบูรณ์ในวารสารที่มีชื่อเสียงที่สุดทางวิทยาศาสตร์สองฉบับ: ธรรมชาติ และ วิทยาศาสตร์.

อย่างไรก็ตามนักวิทยาศาสตร์ยังคงทำงานเพื่อปรับปรุงข้อเสนอและในปี 2549 ลำดับก็เสร็จสมบูรณ์โครโมโซมของมนุษย์.

ความสำคัญและการใช้งาน

การรู้ถึงลำดับของนิวคลีโอไทด์ของโมเลกุลที่สำคัญพอ ๆ กับ DNA นั้นมีค่าสำหรับนักชีววิทยาและผู้เชี่ยวชาญที่เกี่ยวข้อง ห่วงโซ่ของโพลีโนไทด์นี้ประกอบด้วยข้อมูลทั้งหมดที่จำเป็นสำหรับการพัฒนาและบำรุงรักษาทุกรูปแบบของชีวิต.

ด้วยเหตุผลเหล่านี้ความรู้ในลำดับนี้จึงเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการวิจัยทางชีววิทยา พื้นฐานการเรียงลำดับช่วยให้เราสามารถวัดหนึ่งในคุณสมบัติที่สำคัญที่สุดของระบบชีวภาพและเพื่อสร้างความแตกต่างระหว่างพวกเขา.

อนุกรมวิธานใช้กันอย่างแพร่หลายโดยนักอนุกรมวิธานและนักระบบเนื่องจากลำดับดีเอ็นเอบางอย่างอนุญาตให้มีการกำหนดเกณฑ์เพื่อสรุปว่าสิ่งมีชีวิตสองชนิดที่เป็นของสปีชีส์เดียวกันหรือไม่รวมทั้งสามารถเสนอสมมติฐานเกี่ยวกับความสัมพันธ์ทางวิวัฒนาการ.

นอกจากนี้การหาลำดับดีเอ็นเอมีการใช้งานในด้านการแพทย์และการวินิจฉัย ตัวอย่างเช่นมีระบบที่สามารถเข้าถึงได้และราคาไม่แพงซึ่งทำให้เราสามารถประเมินแนวโน้มที่จะพัฒนาโรคบางชนิด (เช่นมะเร็ง) โดยใช้การเรียงลำดับลำดับ (sequencing) ที่เรียกว่า simple nucleotide polymorphisms (SNP).

การสืบสวนประเภทอาชญากรและนิติวิทยาศาสตร์ได้รับการตกแต่งด้วยเทคนิคการเรียงลำดับและสามารถใช้เป็นหลักฐานที่เชื่อถือได้ของการมีส่วนร่วมของบุคคลบางคนในอาชญากรรม.

การอ้างอิง

1. Heather, J. M. , & Chain, B. (2016) ลำดับของ sequencers: ประวัติของลำดับเบส. ฟังก์ชั่น, 107(1), 1-8.
2. Koboldt, D.C. , Steinberg, K.M. , Larson, D.E. , Wilson, R.K. , & Mardis, E.R. (2013) การปฏิวัติลำดับต่อไปและผลกระทบต่อฟังก์ชั่นจีโนม. เซลล์, 155(1), 27-38.
3. ประกาศ, J. (2010). การแข่งขันทางวิทยาศาสตร์. จากกาลิเลโอสู่โครงการจีโนมมนุษย์. บรรณาธิการ Paraninfo.
4. Sanger, F. , Nicklen, S. , & Coulson, A. R. (1977) การหาลำดับดีเอ็นเอด้วยสารยับยั้งการสิ้นสุดของโซ่. การดำเนินการของสถาบันวิทยาศาสตร์แห่งชาติ, 74(12), 5463-5467.
5. Schuster, S. C. (2007) การหาลำดับยุคต่อไปเป็นการแปลงชีววิทยาในปัจจุบัน. วิธีธรรมชาติ, 5(1), 16.
6. Xu, J. (เอ็ด) (2014). การหาลำดับยุคถัดไป. Caister Academic Press.