ลักษณะโปรตีน K, กิจกรรมของเอนไซม์และการใช้งาน

โปรตีเอสเค เป็นเอนไซม์ที่อยู่ในกลุ่มซีรีนโปรตีเอสนั่นคือมันมีตัวเร่งปฏิกิริยาที่เป็นศูนย์กลางของกรดอะมิโนซีรีนและมีหน้าที่ทำลายพันธะเปปไทด์โดยการไฮโดรไลซิส ในทางกลับกันเอนไซม์นี้เป็นของตระกูลโปรตีน subtilisins (peptidase S8).

Proteinase K มีน้ำหนักโมเลกุล (MW) 28,900 daltons และถูกแยกเป็นครั้งแรกในปี 1974 จากสารสกัดของเชื้อรา อัลบั้มภาษาอังกฤษ, ก่อนหน้านี้รู้จักกันในชื่อของ ทริติเรียมอัลบั้ม Limber.

มันมีความสามารถโปรตีนสูงแสดงให้เห็นว่าสามารถลดเคราตินที่มีอยู่ในเส้นผม คำเคราตินในภาษาอังกฤษเขียนว่า "เคราติน" ดังนั้นจึงถูกเรียกว่า "protease K".

เนื่องจากความสามารถสูงในการแยกโปรตีนพื้นเมืองเอนไซม์นี้จึงมีประโยชน์ในเทคนิคทางอณูชีววิทยาต่างๆ ส่วนใหญ่จะใช้ในการแยกและเตรียมกรดนิวคลีอิกที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูง (MW).

Proteinase K ทำหน้าที่โดยการปล่อย DNA นิวเคลียร์ในขณะที่ทำลายโปรตีนและยับยั้ง RNases และ DNases นั่นคือกำจัดนิวเคลียสในการเตรียม DNA และ RNA.

ในทางตรงกันข้ามมันก็เห็นได้ว่า Protease K สามารถไฮโดรไลซ์โปรตีนพื้นเมืองบางชนิดซึ่งได้กระตุ้นความสนใจของนักวิจัยเพื่อใช้ในการศึกษาโปรตีน prion (PrPC).

อย่างไรก็ตามถึงแม้ว่ามันจะมีความสามารถในการเกิดโปรตีนสูง แต่ก็มีโปรตีนที่สามารถต้านทานการทำงานของโปรตีเอสเคในหมู่เหล่านี้มีโปรตีนที่ผิดปกติบางอย่างที่เรียกว่าพรีออน (PrPSc) ซึ่งเกี่ยวข้องกับ.

ดัชนี

• 1 ลักษณะของโปรตีเอสโปรตีน K
• 2 กิจกรรมเกี่ยวกับเอนไซม์
• 3 แอปพลิเคชัน
• 4 ข้อดีของโปรตีเอส
• 5 โปรตีนที่ทนต่อโปรตีน K
• 6 อ้างอิง

คุณสมบัติของโปรตีเอส

Proteinase K มีโครงสร้างระดับอุดมศึกษาที่เกิดขึ้นจากสามชั้นโดยมี seven แผ่นของเจ็ดลูกโซ่คั่นระหว่างสองชั้นของเอนริเก้ เนื่องจากมันเป็นของครอบครัวของ S8 peptidases มันจึงมีลักษณะโดยมีตัวเร่งปฏิกิริยาสามตัวในพื้นที่ทำงานของมันซึ่งเรียงตามลำดับคือ (Asp, His and Ser) ซึ่งแตกต่างจาก peptidases ตระกูลอื่น.

เอนไซม์จากกลุ่มซีรีนโปรตีเอสนี้โดดเด่นด้วยการไฮโดรไลซิลพันธะเปปไทด์ใกล้กับกลุ่มคาร์บอกซิลิกของกรดอะลิฟาติกและอะโรมาติกอะโรมาติก.

ในทางกลับกันก็สามารถที่จะทำหน้าที่ในการปรากฏตัวของสารกัดกร่อนบางอย่างเช่นโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS), Tris-HCL และ EDTA ซึ่งจะใช้ในการช่วย denaturation ของโปรตีนทำให้พวกเขาสูญเสียโครงสร้างดั้งเดิมของพวกเขา.

นี่เป็นขั้นตอนเบื้องต้นในการเตรียมโปรตีนสำหรับเทคนิคอิเล็กโตรโฟรีซิส ช่วง pH ที่ protease K ทำหน้าที่ค่อนข้างกว้าง (2.0 ถึง 12.0) โดยมีค่า pH ที่เหมาะสมระหว่าง 7.5 ถึง 12.0 และจุด isoelectric คือ 8.9 สามารถสังเกตได้ว่ามันทำงานกับค่า pH ที่หลากหลายมาก.

อีกคุณสมบัติหนึ่งที่โดดเด่นในโปรตีเอสเอนไซม์ K คือความเสถียรเมื่อมีอุณหภูมิสูง (50 - 60 ° C).

กิจกรรมของเอนไซม์

Proteinase K ต้องการการมีแคลเซียมไอออนแม้ว่าจะไม่ส่งผลกระทบต่อกิจกรรมของมันหากจำเป็นต่อการรักษาเสถียรภาพ.

เพื่อให้โปรตีเอส K ดำเนินการย่อยอาหารอย่างสมบูรณ์จำเป็นต้องใช้เวลาในการสัมผัสประมาณ 5 นาทีถึง 2 ชั่วโมงโดยประมาณ.

อย่างไรก็ตามในแง่นี้ Daza et al. เปรียบเทียบความบริสุทธิ์ของ DNA ที่ได้รับในหลาย ๆ ครั้งของการสัมผัสกับ protease K และสรุปได้ว่าการฟักตัวนาน (สูงสุด 24 ชั่วโมง) ปรับปรุงคุณภาพของ DNA อย่างมีนัยสำคัญ.

ตอนนี้ในความสัมพันธ์กับความเข้มข้นที่ใช้เอนไซม์ protease K ในโปรโตคอลที่แตกต่างกันก็อาจกล่าวได้ว่ามันมีความหลากหลายมาก.

สามารถใช้จากความเข้มข้นต่ำมาก (5 μg / ml) ถึงความเข้มข้น 500 μg / ml แต่ความเข้มข้นของงานที่พบบ่อยที่สุดอยู่ระหว่าง50-100μg / ml โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการย่อยโปรตีนและการยับยั้ง nuclease แม้ว่าจะมีความเข้มข้น 2 มก. / มล. เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการรักษาเนื้อเยื่อ.

การใช้งาน

แอปพลิเคชันของมันมีขนาดใหญ่มากและสามารถสรุปได้ใน:

-มันถูกใช้ในการย่อยโปรตีนและการสกัด DNA โดยวิธีการต่าง ๆ เช่น: เกลือออก, PK-SDS, cetyl-trimethyl ammonium bromide (CTAB), โพแทสเซียมอะซิเตทดัดแปลงและสกัดด้วยโซเดียมไอโอไดด์.

-การหยุดการทำงานของนิวเคลียส (RNases และ DNases).

-ในเทคนิคการผสมพันธุ์ ในแหล่งกำเนิด (HIS) เพื่อช่วยปลดปล่อยกรดนิวคลีอิกนอกเหนือจากการกำจัดโปรตีนที่ไม่พึงประสงค์.

-การดัดแปลงโปรตีน.

-ในระดับการวิจัยในการศึกษาต่างๆ.

ข้อดีของโปรตีเอสเค

มีการศึกษาเปรียบเทียบหลายครั้งระหว่างเทคนิคการสกัด DNA โดยใช้ Proteinase K กับผู้อื่นที่ไม่ได้ใช้มันและสรุปได้ว่ามีประโยชน์มากขึ้นเมื่อใช้เอนไซม์ ในบรรดาข้อดีดังต่อไปนี้สามารถพูดได้:

-ได้รับ DNA น้ำหนักโมเลกุลสูงที่มีคุณภาพและความบริสุทธิ์สูง.

-DNA ที่ถูกสกัดนั้นมีความเสถียรสูงถึง 3 เดือน.

DNA ที่ถูกแยกสามารถใช้ในเทคนิคต่อไปนี้: Southern blot, polymerase chain reaction (PCR), electrophoresis, และอื่น ๆ.

โปรตีนที่ต้านทานต่อโปรตีเอส

การตรวจสอบที่หลากหลายได้ข้อสรุปว่าพรีออน (โปรตีนที่เป็นพิษของ PrPSc ผิดปกติ) นั้นแตกต่างจากโปรตีน PrPC (ดั้งเดิม) เพราะพวกมันทนต่อการกระทำของโปรตีเอสเคในขณะที่ PrPC มีความไวต่อการกระทำของพวกเขา.

ผู้เขียนคนอื่นได้อธิบายว่าในโครงสร้างของ PrPSc มีส่วนที่ละเอียดอ่อนและอื่น ๆ ที่ต้านทานต่อโปรตีเอสเคอย่างไรก็ตามทั้งสองส่วนมีพิษและติดเชื้อเท่ากัน.

ในทางกลับกันบาสเตียนและผู้ทำงานร่วมกันในปี 1987 ได้แยกโปรตีน 4 ตัวจาก 28, 30, 66 และ 76 kda จากสายพันธุ์ของ Spiroplasma mirum. ทุกคนทนต่อการกระทำของโปรตีเอสเคและยังมีปฏิกิริยาข้ามกับพรีออนบางส่วน.

เป็นที่ทราบกันดีว่าสปีชีส์นี้สามารถทำให้เกิดต้อกระจกและความเสียหายทางระบบประสาทที่สำคัญและเนื่องจากการค้นพบทางวิทยาศาสตร์ของบาสเตียน, ในการสืบสวนอื่น ๆ , มีความพยายามในการสร้างความสัมพันธ์กับจุลินทรีย์นี้.

อย่างไรก็ตามสาเหตุของพยาธิวิทยาทางระบบประสาทที่เสื่อมลงนี้ยังคงมีสาเหตุมาจากพรีออนในปัจจุบัน.

ในแง่นี้บัตเลอร์และผู้ทำงานร่วมกันในปีพ. ศ. 2534 ได้จำแนกและจำแนกระดับโปรตีนที่ต้านทานโปรตีน Kase โปรตีเอส 40 Kda จากสองสายพันธุ์ของ Mycoplasma hyorhinis. เชื้อโรคนี้มีผลต่อหมูติดเชื้อเนื้อเยื่อของพวกเขา แต่ในกรณีนี้ไม่มีปฏิกิริยาข้ามกับพรีออนที่ทดสอบ.

จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่ออธิบายสิ่งแปลกปลอมเกี่ยวกับเรื่องนี้.

การอ้างอิง

1. บาสเตียนเอฟ, เจนนิงส์อาร์, และการ์ดเนอร์ดับเบิลยู. 2530. Antiserum ต่อโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเส้นใยไฟรซิลที่ไม่ถูกต้อง Spiroplasma miruม. โปรตีนไฟบริล เจ. คลีนิก Microbiol 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. การประเมินผลการสกัดดีเอ็นเอและวิธีการทำให้บริสุทธิ์จากเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อในฟอร์มัลดีไฮด์จากศพที่ไม่ปรากฏชื่อ.  นิตยสาร Med, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E และ Mcgarrity G. การบ่งชี้และลักษณะของโปรตีนที่ทนต่อโปรตีน K-in สมาชิกของ Mollicutes ระดับ การติดเชื้อและการสร้างภูมิคุ้มกัน, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. การเปรียบเทียบสองโปรโตคอลสำหรับการสกัด DNA จาก Trypanosoma cruzi ปลูกในสื่อ axenic. รายได้จากเปรู Med. Exp. สาธารณสุข  2014; 31 (2): 222-227 มีจำหน่ายที่: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E และ Palma W. การประเมินประสิทธิภาพของห้าโปรโตคอลการสกัด DNA จากวัสดุพาราฟินสำหรับการศึกษาระดับโมเลกุล Rev Méd Univ คอสตาริกา 2007 1 (1): 10-19.