ลักษณะของสเมียร์แบคทีเรียและการเตรียม

 รอยเปื้อนจากแบคทีเรีย เป็นส่วนขยายในรูปแบบของฟิล์มบาง ๆ ของการระงับแบคทีเรียจุลินทรีย์ที่ดำเนินการบนแผ่นแก้วหรือสไลด์โปร่งใสสำหรับการสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์แสง.

การขยายในรูปแบบของฟิล์มจะดำเนินการเพื่อแยกจุลินทรีย์ให้มากที่สุดเท่าที่จะทำได้เพราะถ้าพวกมันถูกจัดกลุ่มการสังเกตไม่ชัดเจน.

ในการศึกษาเทคนิคการเพาะเชื้อแบคทีเรียในการเตรียมสเมียร์การตรึงและการย้อมสีนั้นใช้ในการวิเคราะห์ได้ดีขึ้น เนื่องจากจุลชีพมีขนาดเล็กจึงจำเป็นต้องใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงเพื่อการสังเกต.

กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงเป็นเครื่องมือที่ขาดไม่ได้ในการสังเกตรอยเปื้อน ใช้เลนส์และแสงที่ให้ภาพตัวอย่างมีขนาดใหญ่ขึ้น.

โดยทั่วไปเซลล์ชีวิตไม่ได้มีโครงสร้างที่มีสีส่วนใหญ่มองผ่านกล้องจุลทรรศน์แสงพวกเขาจะไม่มีสีโปร่งใสตัวอย่างและแสดงความคมชัดภายในน้อยมากและมีสภาพแวดล้อมของพวกเขา.

การสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์สนามแสงอย่างง่ายโดยไม่ใช้เทคนิคการย้อมสีเสริมนั้นมีข้อ จำกัด มากและใช้ในบางกรณีเท่านั้นเช่นในการสังเกตการเคลื่อนไหวของจุลินทรีย์.

ในการสังเกตจุลินทรีย์อย่างเหมาะสมต้องมีความสมดุลระหว่างความคมชัดและความละเอียด รายละเอียดของเซลล์ไม่สามารถสังเกตได้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แม้ที่ความละเอียดสูง การใช้สีย้อมต้องใช้เทคนิคการย้อมสีซึ่งให้ความแตกต่างสำหรับการสังเกต.

ดัชนี

• 1 ลักษณะของสเมียร์แบคทีเรียที่มีคุณภาพดี
  • 1.1 ความเปรียบต่างที่ยอดเยี่ยม
  • 1.2 แก้ไขได้ดี
  • 1.3 การย้อมสีที่ดี
• 2 การเตรียมการ
  • 2.1 A. Frotis
  • 2.2 B. การตรึง
  • 2.3 C. การย้อมสีง่าย
  • 2.4 D. การเก็บรักษาสเมียร์อย่างชัดเจน
• 3 อ้างอิง

ลักษณะของการปนเปื้อนแบคทีเรียที่มีคุณภาพดี

ความคมชัดยอดเยี่ยม

เพื่อให้ได้คอนทราสต์ที่ยอดเยี่ยมจึงมีกล้องจุลทรรศน์อันซับซ้อนเรียกว่า กล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟส, การรบกวนที่แตกต่างกันและกล้องจุลทรรศน์สนามมืด. กล้องจุลทรรศน์ชนิดนี้ใช้สำหรับสังเกตโครงสร้างของแบคทีเรียเช่นฝักและเส้นใย.

การย้อมสีเป็นเทคนิคง่ายๆในการเพิ่มความคมชัดที่ทำได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์ภาคสนามที่ชัดเจน ในเทคนิคนี้สีย้อมต่าง ๆ สามารถใช้ปรับปรุงการสังเกตได้อย่างชัดเจนภายใต้กล้องจุลทรรศน์.

คราบถูกทำโดยตรงกับรอยเปื้อนหรือส่วนขยายของสารแขวนลอยของจุลินทรีย์บนสไลด์ก่อนหน้านี้แห้งและคงที่.

การแก้ไขที่ดี

การตรึงเป็นเทคนิคที่ใช้ในการรักษาโครงสร้างของเซลล์ ทำให้เกิดการปิดใช้งานของเชื้อจุลินทรีย์และการยึดติดกับกระจกของสไลด์ มีการแก้ไขที่แตกต่างกัน: การตรึงความร้อนและการตรึงสารเคมี.

ตรึงความร้อน

นี่เป็นวิธีที่ใช้มากที่สุดในการสังเกตรอยเปื้อนของแบคทีเรีย เทคนิคประกอบด้วยการผ่านการระงับแบคทีเรียของรอยเปื้อนด้วยเปลวไฟของไฟแช็ก เทคนิคนี้สามารถรักษาสัณฐานวิทยาภายนอกของแบคทีเรีย แต่ทำลายโครงสร้างภายในของพวกเขา.

การตรึงทางเคมี

การตรึงสารเคมีใช้สารเคมีในการถนอมเช่นฟอร์มัลดีไฮด์หรือฟอร์มาลดีไฮด์เอทานอลและกรดอะซิติก ข้อได้เปรียบของการใช้สารยึดติดสารเคมีคือการรักษาโครงสร้างเซลล์ภายในของเชื้อจุลินทรีย์.

การย้อมสีที่ดี

ขั้นตอนทั่วไปสำหรับการย้อมสเมียร์ที่แห้งและคงที่ก่อนหน้านี้คือการย้อมสีในเชิงบวกหรือแบบง่ายการย้อมแตกต่างและการย้อมเชิงลบ นอกจากนี้ยังมีเทคนิคพิเศษสำหรับการย้อมโครงสร้างเซลล์โดยเฉพาะ (แคปซูล, สปอร์, แฟลกเทลล่า).

การย้อมสีในเชิงบวกหรือการย้อมสีง่าย

การย้อมสีในเชิงบวกหรือแบบง่ายเป็นเทคนิค smear เปื้อนที่ใช้มากที่สุด ใช้สีย้อมที่มีความสามารถในการจับกับโครงสร้างของจุลินทรีย์บางชนิดทำให้สามารถสังเกตได้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์.

สีย้อมเหล่านี้มีกลุ่ม chromophoric (ส่วนสี) ในโครงสร้างทางเคมีของพวกเขาด้วยการสลับพันธะคู่และพันธะง่าย (ผัน) พันธะเหล่านี้สามารถสร้างพันธะไอออนิกหรือโควาเลนต์ได้ด้วยโครงสร้างของเซลล์.

สีย้อมที่ใช้ในการย้อมสีในเชิงบวกหรือแบบเรียบง่ายส่วนใหญ่เป็นอนุพันธ์ทางเคมีของ วัตถุเหลวคล้ายน้ำมัน (เกลืออินทรีย์สี).

ในทางตรงกันข้ามในสีย้อมเราสามารถหาค่า pH พื้นฐานและอื่น ๆ ที่มีค่าความเป็นกรด.

สีพื้นฐาน

ในสีย้อมพื้นฐานกลุ่ม chromophore มีประจุไฟฟ้าเป็นบวก จุลินทรีย์โปรคาริโอติกส่วนใหญ่มีค่า pH เป็นกลางภายในและพื้นผิวเซลล์จะมีประจุลบ ผ่านการทำงานร่วมกันของไฟฟ้าสถิตนี้ chromophore จับกับเซลล์และย้อมมัน.

ตัวอย่างของสีย้อมพื้นฐานคือเมทิลีนบลูคริสตัลไวโอเล็ตมาลาไคต์สีเขียวฟิวชั่นพื้นฐานซฟรานซินและอื่น ๆ.

สีย้อมกรด

ในสีย้อมกรดกลุ่ม chromophore มีประจุไฟฟ้าลบ สิ่งเหล่านี้ใช้สำหรับการย้อมสีของโปรตีนกับกลุ่มอะมิโนที่มีประจุบวก ตัวอย่างของสีย้อมกรดคือกรด fuscin กุหลาบเบงกอลคองโกเรดและอีโอซิน.

การย้อมสีที่แตกต่างกัน

เทคนิคการย้อมสีที่แตกต่างกันประกอบด้วยการใช้สีย้อมหรือสีที่แตกต่างกันสองสีเพื่อแยกแยะจุลินทรีย์ต่าง ๆ ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ การย้อมสีแกรมและการต้านทานกรด - แอลกอฮอล์เป็นคราบที่ใช้กันมากที่สุดในแบคทีเรีย.

Gram stain ใช้เป็นการทดสอบเบื้องต้นเพื่อทราบรูปร่างขนาดการจัดกลุ่มเซลล์นอกเหนือจากชนิดของผนังเซลล์ จากการทดสอบรอยเปื้อนแกรมแบคทีเรียที่ผนังเซลล์ถูกจำแนกเป็นแบคทีเรียแกรมบวกและแบคทีเรียแกรมลบ.

การย้อมสีเชิงลบ

ในเทคนิคนี้จะใช้สีย้อมเคมีที่ไม่ทะลุเข้าไปในเซลล์ภายใน แต่พวกมันทำหน้าที่สื่อที่จุลินทรีย์ปรากฏเป็นพื้นหลังสีดำ.

ในเทคนิคของการย้อมสีเชิงลบนั้นการทำสเมียร์นั้นทำด้วยการระงับหมึกจีนหรือนิโคตินซึ่งหลังจากปล่อยให้แห้งที่อุณหภูมิห้องจะทำให้เกิดฟิล์มทึบแสงผ่านทางแสง ด้วยวิธีนี้จุลินทรีย์จะสังเกตเห็นว่าเป็นรูปแบบที่สดใสบนพื้นหลังสีดำ.

การจัดเตรียม

A. เปื้อน

1.- ล้างสไลด์อย่างดีแห้งด้วยกระดาษดูดซับแล้วติดฉลาก ฉลากจะต้องระบุเนื้อหาของการเตรียมวันที่และชื่อของบุคคลที่ดำเนินการ.

2.- จุดไฟเบาและฆ่าเชื้อห่วงการฉีดวัคซีนในเปลวไฟจนร้อนแดง.

3.- ปล่อยให้มือจับเย็น.

4.- ใช้หลอดของวัฒนธรรมแบคทีเรีย, ถอดหมวกและผ่านปากหลอดอย่างรวดเร็วใกล้เปลวไฟของไฟแช็ก (เปลวไฟ).

5.- แนะนำลูปการฉีดวัคซีนภายในหลอดที่มีการเพาะเชื้อแบคทีเรียและนำตัวอย่าง.

6.- ถ้าวัฒนธรรมอยู่ในสื่อที่เป็นของเหลวให้วางตัวอย่างที่จับด้วยจุดศูนย์กลางของสไลด์แล้วกระจายอย่างระมัดระวังในวงกลมที่มีเส้นผ่าศูนย์กลางประมาณ 2 ซม..

7.- ฆ่าเชื้อซ้ำในห่วงการฉีดวัคซีน.

8.- อนุญาตให้แห้ง smear ในอากาศ.

9.- ทำซ้ำขั้นตอนที่ 3 ถึง 8 สามครั้ง.

10.- หากวัฒนธรรมอยู่ในสื่อที่เป็นของแข็งควรวางน้ำกลั่นไว้ก่อนหน้านี้บนสไลด์ สิ่งนี้ทำเพื่อผสมตัวอย่างเล็ก ๆ ของวัฒนธรรมที่จับกับการฉีดวัคซีนตามข้อบ่งชี้ของขั้นตอนที่ 2 ถึง 5 (เงื่อนไขของการติดเชื้อ asepsis).

11.- ขยายตัวอย่างเจือจางด้วยหยดน้ำบนสไลด์และทำซ้ำสามครั้ง.

B. การตรึง

1.- เพิ่มรอยเปื้อนแห้ง - ผลิตจากวัฒนธรรมในของเหลวปานกลาง -, เมทานอลสองหยดหรือเอทานอลสัมบูรณ์.

2.- อนุญาตให้แห้งในอากาศห่างจากไฟแช็ค.

3.- ถ้ารอยเปื้อนมาจากวัฒนธรรมในสื่อที่เป็นของแข็งรอยเปื้อนแห้งจะถูกแก้ไขด้วยความร้อนผ่าน 2 ถึง 3 ครั้งอย่างรวดเร็วผ่านพื้นที่ร้อนแรงที่สุดของเปลวไฟของไฟแช็ก.

4.- แตะส่วนล่างของสเมียร์ด้วยส่วนหลังของมือซ้าย (สำหรับมือขวามิฉะนั้นใช้มือขวา) และตรวจสอบว่าเย็น.

C. การย้อมสีง่าย

1.- เพิ่มสีย้อมที่เลือก 2 หยดลงใน smear และปล่อยให้ทำตามเวลาที่กำหนดในโปรโตคอลเฉพาะของแต่ละสีย้อม (ปกติระหว่าง 1 และ 5 นาที).

2.- สีย้อมบางชนิดต้องการการใช้ความร้อนในการกระตุ้นซึ่งในกรณีนี้จำเป็นต้องระมัดระวังเป็นอย่างมากเมื่อให้ความร้อนกับภาพนิ่งในเปลวไฟของไฟแช็ก (จัดการกับแหนบ การมีความร้อนสูงเกินของสเมียร์สามารถทำลายเซลล์ที่คุณต้องการสังเกต.

3.- ลบสีย้อมส่วนเกินโดยการล้างด้วยน้ำกลั่นจาก picette นำน้ำล้างออกโดยแตะที่ขอบสไลด์เบา ๆ เอียงบนโต๊ะทำงาน.

4.- อนุญาตให้อากาศแห้ง.

5.- ขึ้นอยู่กับประเภทของการสังเกตที่ใช้ครอบคลุมหรือไม่ในขั้นตอนนี้ ผ้าคลุมป้องกันและป้องกันรอยเปื้อน หากการสังเกตเกิดขึ้นจากการแช่น้ำมันในขั้นตอนนี้จะไม่มีการใช้ผ้าปิดคลุม แต่จะไม่สามารถเก็บสเมียร์ได้.

D. การเก็บรักษาสเมียร์ขั้นสุดท้าย

1.- เปื้อนป้ายอย่างต่อเนื่องในแต่ละวิธีการแก้ปัญหาที่ระบุด้านล่างเป็นเวลาอย่างน้อย 5 นาที จุดประสงค์ของ "อ่างอาบน้ำ" เหล่านี้คือการทิ้งรอยเปื้อนให้แห้งสนิท รีเอเจนต์แต่ละตัวจะต้องระบายออกก่อนที่จะแนะนำสเมียร์ในอ่างถัดไป.

คำสั่งของการอบแห้งด้วยน้ำมีดังนี้:

1. เอทานอล 70%
2. เอทานอล 95%
3. อะซิโตนบริสุทธิ์
4. ผสม acetone-xylol 1: 1
5. ไซลีน

จากนั้นปล่อยให้อากาศแห้ง.

2.- ติดตั้งฝาปิดโดยเฉพาะอย่างยิ่ง 22 × 22 มม. โดยใช้ยาหม่องแคนาดาหรือวิธีการประกอบอื่น ๆ.

การอ้างอิง

1. Briggs, G. (1965) ปัจจัยเชิงสาเหตุในการเกิดอุบัติเหตุและการติดเชื้อทางห้องปฏิบัติการทางจุลชีววิทยา. ห้องปฏิบัติการชีววิทยาของกองทัพสหรัฐฯ Fort Detrick.
2. Cappucino, J.G. และ Welch, C.T. (2017) จุลชีววิทยา: คู่มือปฏิบัติการ เพียร์สัน.
3. Holt, J.G. บรรณาธิการ (1977) คู่มือการใช้งานของ Bergey ที่สั้นกว่าของแบคทีเรียที่กำหนด 8^TH บัลติมอร์: บริษัท เดอะวิลเลียมส์แอนด์วิลคินส์.
4. Johnson, T.R. และกรณี; C.L. (2018) การทดลองในห้องปฏิบัติการทางจุลชีววิทยา. เพียร์สัน.
5. Tille, P. (2017) จุลชีววิทยาวินิจฉัย 14^TH St. Louis, USA: Elsiever, Inc.