ฟังก์ชันของเอนไซม์ที่ จำกัด กลไกการออกฤทธิ์ประเภทและตัวอย่าง

เอนไซม์ จำกัด เป็น endonucleases ที่ Archaea และแบคทีเรียบางตัวใช้ในการยับยั้งหรือ "จำกัด " การแพร่กระจายของไวรัสที่อยู่ภายใน พวกมันมีอยู่ทั่วไปในแบคทีเรียและเป็นส่วนหนึ่งของระบบป้องกัน DNA ต่างประเทศที่รู้จักกันในชื่อระบบการ จำกัด / การดัดแปลง.

เอนไซม์เหล่านี้กระตุ้นให้เกิดการตัดดีเอ็นเอที่มีเกลียวสองเส้นในบางพื้นที่ซึ่งสามารถทำซ้ำได้และไม่ต้องใช้พลังงานเพิ่มเติม ส่วนใหญ่ต้องการการปรากฏตัวของปัจจัยร่วมเช่นแมกนีเซียมหรือไพเพอร์ประจุบวกอื่น ๆ แม้ว่าบางรายอาจต้องการ ATP หรือ S-adenosyl methionine.

ข้อ จำกัด ของเอ็นโดนิเคิลถูกค้นพบในปี 1978 โดย Daniel Nathans, Arber Werner และ Hamilton Smith ผู้ได้รับรางวัลโนเบลสาขาการแพทย์สำหรับการค้นพบของพวกเขา ชื่อของมันมักจะมาจากสิ่งมีชีวิตที่พวกเขาจะถูกสังเกตเป็นครั้งแรก.

เอนไซม์ดังกล่าวใช้กันอย่างแพร่หลายในการพัฒนาวิธีการโคลนดีเอ็นเอและชีววิทยาโมเลกุลอื่น ๆ และกลยุทธ์ทางพันธุวิศวกรรม ลักษณะการรับรู้ของลำดับเฉพาะและความสามารถในการตัดลำดับใกล้กับไซต์ที่ได้รับการยอมรับทำให้เป็นเครื่องมือที่ทรงพลังในการทดลองทางพันธุกรรม.

ชิ้นส่วนที่สร้างขึ้นโดยเอนไซม์ จำกัด ที่ทำหน้าที่ในโมเลกุล DNA เฉพาะสามารถใช้สร้าง "แผนที่" ของโมเลกุลดั้งเดิมโดยใช้ข้อมูลเกี่ยวกับไซต์ที่เอนไซม์ตัด DNA.

เอนไซม์ที่มีข้อ จำกัด บางตัวอาจมีไซต์ที่รับรู้เหมือนกันใน DNA แต่พวกมันไม่จำเป็นต้องตัดมันด้วยวิธีเดียวกัน ดังนั้นจึงมีเอ็นไซม์ที่ทำให้การตัดออกจากปลายทู่และเอ็นไซม์ที่ตัดออกจากปลายเหนียวซึ่งมีการใช้งานที่แตกต่างกันในอณูชีววิทยา.

ในปัจจุบันมีเอนไซม์ จำกัด ที่มีจำหน่ายในท้องตลาดหลายร้อยชนิดซึ่งมีอยู่ทั่วไปในเชิงพาณิชย์ เอ็นไซม์เหล่านี้ทำงานเช่นเดียวกับการใช้กรรไกรแบบ "กำหนดเอง" เพื่อวัตถุประสงค์ที่แตกต่างกัน.

ดัชนี

• 1 ฟังก์ชั่น
• 2 กลไกการออกฤทธิ์
• 3 ประเภท
  • 3.1 เอนไซม์ จำกัด ชนิดที่ 1
  • 3.2 เอนไซม์ข้อ จำกัด Type II
  • 3.3 เอนไซม์ III ข้อ จำกัด ชนิดที่สาม
  • 3.4 เอนไซม์ประเภท IV ข้อ จำกัด
  • 3.5 เอนไซม์ V ชนิดข้อ จำกัด
• 4 ตัวอย่าง
• 5 อ้างอิง

ฟังก์ชั่น

เอ็นไซม์ จำกัด ทำหน้าที่ตรงข้ามกับโพลิเมอร์เนื่องจากไฮโดรไลซ์หรือทำลายพันธะเอสเตอร์ภายในพันธะฟอสโฟเซสเตอร์ระหว่างนิวคลีโอไทด์ที่อยู่ติดกันในโซ่นิวคลีโอไทด์.

ในด้านอณูชีววิทยาและพันธุวิศวกรรมพวกมันเป็นเครื่องมือที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการสร้างการแสดงออกและการโคลนเวกเตอร์รวมทั้งการระบุลำดับที่เฉพาะเจาะจง พวกมันยังมีประโยชน์สำหรับการสร้างจีโนม recombinant และมีศักยภาพทางเทคโนโลยีชีวภาพที่ดี.

ความก้าวหน้าล่าสุดในการบำบัดด้วยยีนทำให้ปัจจุบันใช้เอนไซม์ จำกัด สำหรับการนำยีนบางตัวเข้าสู่เวกเตอร์ซึ่งเป็นยานพาหนะสำหรับการขนส่งยีนดังกล่าวไปยังเซลล์ที่มีชีวิตและอาจมีความสามารถที่จะถูกแทรกเข้าไปในจีโนมเซลล์ การเปลี่ยนแปลงแบบถาวร.

กลไกการออกฤทธิ์

เอ็นไซม์ จำกัด สามารถกระตุ้นการตัด DNA แบบเกลียวคู่แม้ว่าบางตัวสามารถรับรู้ลำดับดีเอ็นเอแบบเส้นเดี่ยวและแม้แต่อาร์เอ็นเอ การตัดเกิดขึ้นหลังจากการรับรู้ลำดับ.

กลไกการออกฤทธิ์ประกอบด้วยการไฮโดรไลซิสของพันธะฟอสโฟลิสเตอร์ระหว่างกลุ่มฟอสเฟตและดีโอซีโบซีโบสในกระดูกสันหลังของดีเอ็นเอแต่ละเส้น เอ็นไซม์จำนวนมากสามารถตัดในที่เดียวกับที่พวกเขารับรู้ในขณะที่คนอื่น ๆ ตัดระหว่าง 5 ถึง 9 คู่เบสก่อนหรือหลัง.

โดยปกติแล้วเอนไซม์เหล่านี้จะถูกตัดที่ส่วนปลาย 5 'ของกลุ่มฟอสเฟตทำให้เกิดชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ปลายฟอสโฟรีล 5' และปลายไฮดรอกซิลขั้ว 3.

เนื่องจากโปรตีนไม่ได้สัมผัสโดยตรงกับสถานที่ที่ได้รับการยอมรับใน DNA พวกเขาจะต้องทำการย้ายตำแหน่งอย่างต่อเนื่องจนกว่าพวกมันจะไปถึงสถานที่ที่เฉพาะเจาะจงบางทีโดยใช้กลไก "เลื่อน" บนเกลียวดีเอ็นเอ.

ในระหว่างการตัดเอนไซม์การเชื่อมโยงฟอสโฟดีเอสเตอร์ของ DNA แต่ละเส้นจะอยู่ในตำแหน่งที่ทำงานอยู่ในเอนไซม์ที่ จำกัด เมื่อเอนไซม์ออกจากการรับรู้และการตัดมันจะทำผ่านความสัมพันธ์ชั่วคราวที่ไม่เฉพาะเจาะจง.

ชนิด

ปัจจุบันรู้จักเอนไซม์ จำกัด ห้าชนิด ด้านล่างนี้เป็นคำอธิบายโดยย่อของแต่ละรายการ:

เอ็นไซม์ จำกัด ชนิดที่ 1

เอนไซม์เหล่านี้เป็นโปรตีนเพนทาเมอร์ขนาดใหญ่ที่มีสามหน่วยย่อย, ข้อ จำกัด , เมธิลและอื่น ๆ สำหรับการรับรู้ของลำดับใน DNA เอนโดนิเคิลเหล่านี้เป็นโปรตีนมัลติฟังก์ชั่นที่มีความสามารถในการเร่งปฏิกิริยาการ จำกัด และปฏิกิริยาการปรับเปลี่ยนมีกิจกรรม ATPase และ DNA topoisomerase.

เอ็นไซม์ประเภทนี้เป็นเอ็นโดนิเคิลแรกที่ถูกค้นพบพวกมันบริสุทธิ์เป็นครั้งแรกในปี 1960 และตั้งแต่นั้นมาพวกเขาได้รับการศึกษาอย่างลึกซึ้ง.

เอ็นไซม์ Type I ไม่ได้ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในฐานะเครื่องมือทางเทคโนโลยีชีวภาพเนื่องจากพื้นที่ตัดสามารถอยู่ที่ระยะทางแปรผันสูงถึง 1,000 คู่เบสจากไซต์รับรู้ซึ่งทำให้พวกมันไม่น่าเชื่อถือในแง่ของการทำซ้ำการทดลอง.

เอนไซม์ข้อ จำกัด Type II

พวกเขาเป็นเอนไซม์ที่ประกอบด้วย homodimers หรือ tetramers ที่ตัด DNA ที่ไซต์ที่กำหนดระหว่างความยาว 4 ถึง 8 bp ไซต์ตัดเหล่านี้มักเป็น palindromic นั่นคือพวกมันรู้จักลำดับที่อ่านในลักษณะเดียวกันทั้งสองทิศทาง.

เอ็นไซม์ จำกัด ประเภท II จำนวนมากในแบคทีเรียตัด DNA เมื่อพวกเขาจำลักษณะต่างประเทศของพวกเขาได้เนื่องจากพวกเขาไม่มีการดัดแปลงแบบทั่วไปที่ DNA ของตัวเองควรมี.

เอนไซม์เหล่านี้เป็นข้อ จำกัด ที่ง่ายที่สุดเนื่องจากพวกมันไม่ต้องการปัจจัยอื่นใดนอกเหนือจากแมกนีเซียม (Mg +) ในการรับรู้และตัดลำดับดีเอ็นเอ.

ความถูกต้องของเอนไซม์ จำกัด ชนิด II ในการจดจำและตัดลำดับง่าย ๆ ใน DNA ในตำแหน่งที่แม่นยำทำให้พวกมันเป็นหนึ่งในสิ่งที่ใช้มากที่สุดและขาดไม่ได้ในสาขาชีววิทยาโมเลกุลส่วนใหญ่.

ภายในกลุ่มของเอ็นไซม์ จำกัด ประเภท II นั้นมีคลาสย่อยหลายคลาสที่จำแนกตามคุณสมบัติบางอย่างที่ไม่ซ้ำกันสำหรับแต่ละคน การจำแนกประเภทของเอนไซม์เหล่านี้ทำได้โดยการเพิ่มตัวอักษรของตัวอักษรจาก A ถึง Z ตามด้วยชื่อของเอนไซม์.

คลาสย่อยบางคลาสที่รู้จักกันดีสำหรับประโยชน์ของมันคือ:

คลาสย่อย IIA

พวกมันเป็นหน่วยย่อยที่แตกต่างกัน พวกเขารับรู้ลำดับที่ไม่สมดุลและใช้เป็นสารตั้งต้นที่เหมาะสำหรับการสร้างเอนไซม์ตัด.

คลาสย่อย IIB

พวกมันประกอบด้วยอีกหนึ่ง dimers และตัด DNA ทั้งสองด้านของลำดับการรับรู้ พวกเขาตัดดีเอ็นเอทั้งสองเส้นในช่วงของเบสคู่ที่อยู่นอกเหนือไซต์ที่ได้รับการยอมรับ.

คลาสย่อย IIC

เอนไซม์ประเภทนี้คือโพลีเปปไทด์ที่มีฟังก์ชั่นของการแบ่งตัวและการดัดแปลงของสายดีเอ็นเอ เอนไซม์เหล่านี้จะตัดทั้งสองเส้นอย่างไม่สมมาตร.

คลาสย่อย IIE

เอนไซม์ของคลาสย่อยนี้มีการใช้มากที่สุดในพันธุวิศวกรรม พวกเขามีเว็บไซต์เร่งปฏิกิริยาและโดยทั่วไปต้องมี effector allosteric เอ็นไซม์เหล่านี้จำเป็นต้องโต้ตอบกับลำดับการจดจำสองชุดเพื่อให้การตัดมีประสิทธิภาพ ภายในคลาสย่อยนี้เป็นเอ็นไซม์ EcoRII และ EcoRI.

เอนไซม์ข้อ จำกัด ประเภทที่สาม

ประเภทที่สาม จำกัด endonucleases ประกอบด้วยสองหน่วยย่อยคนหนึ่งมีหน้าที่รับผิดชอบในการรับรู้และการดัดแปลงดีเอ็นเอในขณะที่คนอื่น ๆ มีหน้าที่รับผิดชอบในการตัดลำดับ.

เอ็นไซม์เหล่านี้ต้องการโคแฟคเตอร์สองอันสำหรับการทำงาน: ATP และแมกนีเซียม เอ็นไซม์ จำกัด ของประเภทนี้มีสองเว็บไซต์ที่ได้รับการยอมรับไม่สมมาตรย้ายดีเอ็นเอในลักษณะที่ขึ้นกับเอทีพีและตัดระหว่าง 20 ถึง 30 bp ที่อยู่ติดกับเว็บไซต์รับรู้.

เอ็นไซม์ จำกัด ประเภท IV

เอนไซม์ชนิดที่ 4 นั้นง่ายต่อการระบุเนื่องจากพวกเขาตัด DNA ด้วยเมธิลแท็กพวกมันประกอบด้วยหน่วยย่อยที่แตกต่างกันหลายหน่วยที่รับผิดชอบในการรับรู้และตัดลำดับดีเอ็นเอ เอนไซม์เหล่านี้ใช้เป็นโคแฟคเตอร์ GTP และแมกนีเซียมแบบคู่.

ไซต์เฉพาะสำหรับการตัด ได้แก่ โซ่นิวคลีโอไทด์ที่มีตกค้างของ methylated หรือ hydroxymethylated cytosine ในหนึ่งหรือทั้งสองเส้นของกรดนิวคลีอิก.

เอ็นไซม์ จำกัด ประเภท V

การจำแนกประเภทนี้จัดกลุ่มเอนไซม์ประเภท CRISPER-Cas ซึ่งระบุและตัดลำดับดีเอ็นเอที่เฉพาะเจาะจงจากสิ่งมีชีวิตที่บุกรุก เอ็นไซม์ Cas ใช้สายของ CRISPER สังเคราะห์แนวทาง RNA ในการรับรู้และโจมตีสิ่งมีชีวิตที่บุกรุก.

เอ็นไซม์ที่จัดเป็นประเภท V เป็นโพลีเปปไทด์ที่มีโครงสร้างโดยเอนไซม์ชนิด I, II และ II พวกเขาสามารถตัดส่วนของ DNA ของสิ่งมีชีวิตเกือบทุกชนิดและด้วยความยาวที่หลากหลาย ความยืดหยุ่นและความสะดวกในการใช้งานทำให้เอนไซม์เหล่านี้เป็นหนึ่งในเครื่องมือที่ใช้กันมากที่สุดในด้านพันธุวิศวกรรมในปัจจุบันพร้อมกับเอ็นไซม์ Type II.

ตัวอย่าง

เอ็นไซม์ จำกัด ได้ถูกนำมาใช้ในการตรวจจับความหลากหลายของดีเอ็นเอโดยเฉพาะอย่างยิ่งในการศึกษาพันธุศาสตร์ประชากรและการศึกษาวิวัฒนาการโดยใช้ไมโตคอนเดรียดีเอ็นเอเพื่อรับข้อมูลเกี่ยวกับอัตราการทดแทนนิวคลีโอไทด์.

ในปัจจุบันเวกเตอร์ที่ใช้สำหรับการเปลี่ยนแปลงของแบคทีเรียที่มีจุดประสงค์ที่แตกต่างกันนั้นมีไซต์หลายเซลล์ที่พบไซต์ที่จดจำเอนไซม์หลายตัว.

ในบรรดาเอนไซม์เหล่านี้สิ่งที่ได้รับความนิยมสูงสุดคือ EcoRI, II, III, IV และ V ซึ่งได้รับและอธิบายเป็นครั้งแรก อี. โคไล; HindIII จาก H. influenzae และของ BamHI B. amyloliquefaciens.

การอ้างอิง

1. Bickle, T. A. , & Kruger, D. H. (1993) ชีววิทยาการ จำกัด DNA. ความคิดเห็นทางจุลชีววิทยา, 57(2), 434-450.
2. Boyaval, P. , Moineau, S. , Romero, D. A. , & Horvath, P. (2007) CRISPR ให้ความต้านทานต่อไวรัสในโปรคาริโอต. วิทยาศาสตร์, 315(มีนาคม), 1709-1713.
3. Goodsell, D. (2002) มุมมองระดับโมเลกุล: ข้อ จำกัด เอ็นโดนิเคิล. สเต็มเซลล์พื้นฐานของการแพทย์โรคมะเร็ง, 20, 190-191.
4. Halford, S. E. (2001) กระโดดกระโดดและวนลูปโดยเอ็นไซม์ จำกัด. ธุรกรรมทางชีวเคมีสังคม, 29, 363-373.
5. Jeltsch, A. (2003) การบำรุงรักษาเอกลักษณ์ของสายพันธุ์และการควบคุม speciation ของแบคทีเรีย: ฟังก์ชันใหม่สำหรับระบบ จำกัด / แก้ไข? ยีน, 317, 13-16.
6. Krebs, J. , Goldstein, E. , & Kilpatrick, S. (2018). ยีนของ Lewin XII (12 ed.) เบอร์ลิงตันแมสซาชูเซตส์: Jones & Bartlett Learning.
7. Li, Y. , Pan, S. , Zhang, Y. , Ren, M. , Feng, M. , Peng, N. , ... เธอ, Q. (2015) การควบคุมระบบ Type I และ Type III CRISPR-Cas สำหรับการแก้ไขจีโนม. การวิจัยกรดนิวคลีอิก, 1-12.
8. Loenen, W. A.M. , Dryden, D.T. F. , Raleigh, E.A. , & Wilson, G.G. (2013) พิมพ์ฉัน จำกัด เอนไซม์และญาติของพวกเขา. การวิจัยกรดนิวคลีอิก, 1-25.
9.  Nathans, D. , & Smith, H. O. (1975) Restriction Endonucleases ในการวิเคราะห์และปรับโครงสร้างโมเลกุลดีเอ็นเอ. Annu รายได้จาก Biochem., 273-293.
10.  Nei, M. , & Tajima, F. (1981) Dna polymorphism ตรวจพบได้โดย endonucleases ที่ จำกัด. พันธุศาสตร์, 145-163.
11.  Pingoud, A. , Fuxreiter, M. , Pingoud, V. , & Wende, W. (2005) เซลล์ จำกัด และโมเลกุลวิทยาศาสตร์สิ่งมีชีวิตประเภท II endonucleases: โครงสร้างและกลไก. CMLS วิทยาศาสตร์เซลล์และโมเลกุลชีวิต, 62, 685-707.
12.  Roberts, R. (2005) การ จำกัด เอนไซม์กลายเป็นผลงานของชีววิทยาโมเลกุลได้อย่างไร. PNAS, 102(17), 5905-5908.
13.  โรเบิร์ต, R. J. , & Murray, K. (1976) จำกัด เอ็นโดนิเนสของข้อ จำกัด. การวิจารณ์เชิงวิจารณ์ทางชีวเคมี, (พฤศจิกายน), 123-164.
14.  Stoddard, B. L. (2005) โครงสร้างและฟังก์ชั่น endonuclease กลับบ้าน. ความคิดเห็นเกี่ยวกับชีวฟิสิกส์ทุกไตรมาส, 1-47.
15.  Tock, M. R. , & Dryden, D. T. F. (2005) ชีววิทยาของข้อ จำกัด และการต่อต้านข้อ จำกัด. ความคิดเห็นปัจจุบันทางจุลชีววิทยา, 8, 466-472 https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
16.  วิลสัน, G. G. , & Murray, N. E. (1991) ระบบข้อ จำกัด และการดัดแปลง. Annu รายได้ Genet., 25, 585-627.
17.  Wu, Z. , & Mou, K. (2016) ข้อมูลเชิงลึกทางพันธุกรรมของ Campylobacter jejuni virulence และพันธุศาสตร์ประชากร. ทำให้ติดเชื้อ Dis ภาษา Med., 2(3), 109-119.
18.  หยวนร. (1981) โครงสร้างและกลไกของเอนโดนิเคิลข้อ จำกัด มัลติฟังก์ชั่น. Annu รายได้จาก Biochem., 50, 285-315.